Un régulée par la tetracycline lignée cellulaire produit vecteurs lentiviraux titre élevé qui ciblent spécifiquement les cellules dendritiques

Résumé

Ici, nous utilisons transduction rétrovirale et transfection concatémérique pour créer une lignée cellulaire qui peut exprimer les composantes d'un vecteur lentivirus (LV) en l'absence de tétracycline. Ce LV code pour la GFP et est pseudotypé avec une glycoprotéine, SVGmu, qui est spécifique d'un récepteur sur les cellules dendritiques.

Résumé

Les vecteurs lentiviraux (LV) sont un puissant moyen de fournir du matériel génétique à de nombreux types de cellules. En raison de problèmes de sécurité liés à ces VIH-1 vecteurs dérivés, produisant de grandes quantités de volumes logiques est difficile. Dans cet article, nous présentons une méthode pour produire des titres élevés d'VL auto-inactivant. Nous transduire rétrovirale le tet-off stable producteur lignée cellulaire GPR pour produire une lignée cellulaire, GPRS, qui peut exprimer tous les composants viraux, dont une glycoprotéine spécifique de la cellule dendritique, SVGmu. Ensuite, nous utilisons la transfection d'ADN concatémérique pour transfecter le transfert plasmide codant pour la GFP LV un gène rapporteur en combinaison avec un marqueur sélectionnable. Plusieurs des clones obtenus peuvent produire LV à un titre de 10 fois supérieure à ce que nous réalisons avec transfection transitoire. De plus, ces virus transduire efficacement des cellules dendritiques in vitro et génèrent une forte réponse immunitaire cellulaire de T à notre antigène de journaliste. Cette méthode peut être une bonne option for la production de vaccins à base de fortes LV pour les études cliniques de cancer ou de maladies infectieuses.

Introduction

Beaucoup de systèmes de vecteurs ont été développés pour la livraison de gènes. Vecteurs basés sur les lentivirus ont été parmi système virale la plus couramment étudiée. Ces vecteurs sont avantageux car ils peuvent transduire efficacement à la fois la division et non les cellules en division ^1, obtenir une expression à long terme en raison de l'intégration dans le génome de l'hôte, présentent une faible immunité anti-vecteur naturel dans la plupart des populations humaines ^2, et ont un faible potentiel de génotoxicité de mutagenèse par insertion ^3,4.

La production de lentivirus a toujours été colorée par des préoccupations de sécurité. Les vecteurs lentiviraux sont généralement dérivés du VIH-1, l'agent étiologique du sida. Transfection transitoire de composants individuels du lentivector (transfert, l'enveloppe, et des plasmides d'emballage) est un moyen commun et flexible de livrer du matériel génétique en laboratoire. Cependant, l'extension des transfections transitoires pour des applications cliniques est lourd et may conduire à l'élaboration de lentivirus compétent pour la réplication ^5,6. Pour surmonter ces obstacles, plusieurs emballage stable et lignées cellulaires de production ont été développées ^6-11. Une de ces lignes, la ligne de conditionnement GPR ^11, présente l'avantage d'être attrayant régulée par la tétracycline. Dans cet article, nous montrons comment adapter ce système à produire des auto-inactivant les vecteurs lentiviraux qui sont spécifiquement ciblés vers les cellules dendritiques (DC-LV) ^12.

Les cellules dendritiques (CD) sont des cellules présentatrices d'antigène les plus solides du système immunitaire. Ils ont fait l'objet d'un grand intérêt dans le développement du vaccin contre le cancer parce qu'ils initient directement, programme et régulent les réponses immunitaires spécifiques de la tumeur ^13. Intégrant un protocole de vaccination afin d'inclure les PED a le potentiel de déclencher une réponse immunitaire antitumorale plus forte que peptidiques ou vaccins ADN. Récemment, nous avons développé un vecteur lentivirus qui specifically cible les cellules dendritiques par une glycoprotéine du virus de la sindbis modifiée, SVGmu ^14. Ces vecteurs sont uniques en ce qu'ils montrent une grande spécificité pour les cellules dendritiques et générer des réponses immunitaires plus fortes que non spécifiques, vecteurs VSVg-pseudotypées.

Ici, nous présentons une méthode pour produire de grandes quantités de ces vecteurs lentiviraux DC ciblées. Nous démontrons que ces DC-LV peut infecter les PED et générer de fortes réponses immunitaires T CD8 ⁺ de cellules T. Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées avec humanité, sous l'approbation de l'USC Intitutional protection des animaux et le Comité d'utilisation. Afin de réaliser des expériences in vivo et clinique, il est essentiel de créer une lignée cellulaire qui peut produire des virus à un titre élevé. Effectuer les étapes de transduction et transfection exactement comme décrit permettra de maximiser les chances de générer un tel clone.

Protocole

Cellules productrices stables DC-LV sont construits sur la base de l'emballage de ¹¹ lignée cellulaire GPR qui contient les composants lentiviral gagpol nécessaire, rev et le système Tet-off. Tout d'abord, la transduction rétrovirale est utilisé pour générer une lignée cellulaire de conditionnement GPRS qui code pour une glycoprotéine SVGmu tet-dépendante. Ensuite, concatémère tableau transfection est utilisé pour transfecter la lignée cellulaire GPRS avec un vecteur lentiviral transgène tel que la GFP. Cette lignée cellulaire productrice stable, désigné comme LV-mGFP, peut être testé in vitro et in vivo pour sa capacité à produire un vaccin DC-LV contre la GFP.

1. Génération d'une lignée cellulaire SVGmu Tet-dépendante

Le plasmide PRX-SVGmu est une construction dans laquelle la glycoprotéine SVGmu DC-spécifique est cloné en aval du promoteur tTA avancé de plasmide rétroviral pRetroX-Tet-Off ¹ (figure 1C). 293T de la culture dans D10 (milieu de Eagle modifié par Dulbecco avec10% de sérum de veau foetal, 2 mM L-glutamine). Culture lignée cellulaire d'emballage GPR en D10 avec la doxycycline (1 ng / ml) et la puromycine (2 pg / ml). Toutes les cellules sont mises en culture dans une atmosphère humidifiée à 37 ° C incubateur avec 5% de CO _2.

1. 16-18 h avant transfection transitoire, plaque 2 x 10 ⁶ cellules 293T à 4 ml de D10 dans une boîte de culture tissulaire de 6 cm de telle sorte que les cellules approchent 90% de confluence au moment de la transfection.
2. La transfection de plasmides rétroviraux: mélange 100 pi 1,25 M _CaCl2 solution stérile, l'eau Milli-Q et les plasmides suivants: 5 ug PRX-SVGmu, 2,5 pg pgag-Pol, 2,5 pg pVSV-G. Le volume final est de 500 pi. Pour un polystyrène tube 5 ml à fond rond, ajouter 500 ul 2X HBS (HEPES 50 mM, 10 mM de KCl, 12 mM de dextrose, NaCl 280 mM, 1,5 mM Na ₂ HPO ₄ * 7H ₂ O, pH 7,05). Ajouter le mélange goutte à goutte plasmide dans le tampon HBS 2X tout en faisant barboter le tampon vigoureusement avec une pipette Pasteur en verre. Après avoir ajouté le mixture, continuer bouillonnant pour un autre 30 secondes. Ensuite, ajoutez la totalité du mélange sur les cellules 293T à la boîte de culture de 6 cm, et incuber à 37 ° C.
3. 4 heures après transfection, remplacer soigneusement le milieu dans la boîte de culture avec 4 ml D10 préchauffé.
4. Spin infection: 48 heures après transfection, la récolte SVGmu codant pour des particules rétrovirales dans le surnageant en passant le surnageant à travers un filtre de 0,45 um. Plaque les cellules de conditionnement GPR dans un plat de 24 puits à 2 x 10 ⁴ cellules / puits. Ajouter surnageant filtré de cellules d'encapsidation GPR dans le plat (2 ml / puits) et des cellules de centrifugation pendant 90 min à 1050 x g et 25 ° C. Changer le milieu dans D10 frais avec de la doxycycline (1 ng / ml) après spin-infection (2 ml / puits).
5. 72 heures après la transfection, développez la culture de cellules transduites d'emballage en D10 avec la doxycycline (1 ng / ml) et la puromycine (2 ng / ml).
6. Pour confirmer l'expression de SVGmu, culture des cellules sans doxycycline pendant 48 heures. Mesurer ex de surfacepression de SVGmu avec la cytométrie de flux en utilisant anti-Sindbis sérum. Ces cellules sont désignées en tant que lignée cellulaire d'empaquetage GPRS.

2. Construire DC-LV cellules productrices par Concatémère tableau transfection

Lentivirale plasmide de transfert TL20-GFP est une auto-inactivant lentiviral transfert vecteur plasmidique basé sur pCL20c-MSCV-GFP avec un système Dox-régulable ARN viral expression du génome et le remplacement du cytomégalovirus (CMV) activateur avec 7 tet opérateurs (figure 1C) ^{11 , 12,15.} Plasmide PGK-ble est un résistant bléomycine (BLE) Cassette entraînée par un promoteur PGK faible ^2.

1. Digest 20 pg de plasmide TL20-GFP avec l'enzyme de restriction SfiI à 50 ° C. Digest 20 ug de plasmide PGK-ble avec PflMI à 37 ° C.
2. Purifier les fragments d'ADN (la cassette PGK-ble est de 1011 pb et le vecteur TL20-GFP est 6861 pb) par électrophorèse sur gel d'agarose.
3. Ligaturer le TL20-GFP et PGK-Cassette ble à un rapport molaire de 25:1 (ONE ADN ligase de T4). Incuber une nuit à température ambiante.
4. Après ligature du jour au lendemain, de purifier l'ADN à partir du mélange de ligature (Qiagen DNeasy Sang et Kit de tissus). Assurer la quantité d'ADN purifié est d'environ 5 ug.
5. 16-18 h avant la transfection, les cellules de conditionnement GPRS plaque dans une boîte de culture tissulaire de 6 cm de telle sorte que la confluence sera d'environ 90% au moment de la transfection.
6. Utilisez la méthode de transfection au phosphate de calcium décrite à l'étape 1.2 pour la transfection de 5 ug de l'ADN purifié concatémérique dans les cellules de conditionnement GPRS dans la boîte de culture tissulaire de 6 cm. 4 heures après transfection, retirez soigneusement le support et la remplacer par 4 ml D10 préchauffé avec de la doxycycline (1 ng / ml).
7. 48 heures après transfection, changer le milieu dans D10 avec la doxycycline (1 ng / ml) et la puromycine (2 pg / ml). Sélectionner des clones transfectées par l'ajout zeocine (50 pg / ml) dans le milieu de culture. Culture des cellules pour environ 2 semaines jusqu'à cellule colonisationes est visible en bas de la vaisselle.
8. Étiquette les colonies de cellules au fond de la vaisselle. Prenez des boîtes de culture tissulaire à 24 puits, nombre des puits et ajouter dans chaque puits 2 ml contenant zeocine D10 (50 pg / ml), la doxycycline (1 ng / ml), et la puromycine (2 pg / ml). Aspirer le milieu des cellules transduites, puis ajouter une goutte de la trypsine sur chacune des colonies pendant moins d'une minute. Ensuite, ajoutez un ou plusieurs gouttes de D10 sur les mêmes colonies. Ramassez colonies, un par un avec une pipette et transférer dans des réservoirs séparés de la plaque de culture tissulaire à 24 puits.
9. Culture et développer tous les clones de cellules en D10 contenant zeocine (50 pg / ml), la doxycycline (1 ng / ml) et la puromycine (2 pg / ml) pour l'évaluation de la capacité de production virale.

3. Évaluer la production virale de chaque clone cellulaire

1. Trypsiniser les cellules productrices et la plaque autour de 4x10 ⁶ cellules en 6 cm boîte de culture tissulaire dans D10 sans doxycycline tels que la confluencesupérieur à 90%. Remplacez le support avec D10 frais préchauffé quotidienne et recueillir le support pour le titre dosage 72 heures après le retrait dox.
2. Récolter le surnageant viral par le moyen de filtrage avec un filtre de 0,45 um.
3. cellules cibles des plaques exprimant le récepteur DC-SIGN (par exemple 293T.hDC-signe ou la moelle osseuse de souris cellules dendritiques dérivées ¹⁶⁾ et 293T comme contrôle négatif dans des boîtes de culture de 96 puits, 1 x 10 ⁴ cellules / puits. Ajouter des dilutions en série de 2 fois du surnageant viral dans les puits (100 pl / puits). Généralement, 8.6 dilutions sont suffisantes pour atteindre la plage dans laquelle les cellules transduites GFP-positives sont dans une relation linéaire avec la quantité de virus ajouté.
4. Centrifuger les cellules et remplacer le support tel que décrit dans l'étape 1.4. BMDCs doivent être cultivées dans un milieu RPMI avec 10% de FBS et GM-CSF (1:20 moyen J558L conditionné).
5. Mesurer l'expression de la GFP dans les cellules transduites par cytométrie de flux 4-6 jours post-transduction. Le vecto lentiviralr titre est calculé dans la gamme de dilution de vecteur lorsque le pourcentage de cellules GFP-positives et le montant de vecteur sont dans une relation linéaire. Choisissez le clone cellulaire avec la production virale plus élevée pour les applications suivantes.

4. Produire et de concentrés vecteurs lentiviraux

1. Culture de la lignée cellulaire de producteur (LV-mGFP) dans des boîtes de culture de tissu de 15 cm.
2. Trypsiniser les cellules productrices et les cellules de la plaque dans les boîtes de culture tissulaire de 15 cm à plus de 90% de confluence dans D10 frais sans doxycycline. Changer le milieu avec des produits frais D10, préchauffé quotidien.
3. Au moment de la production virale maximale (tel que déterminé par l'utilisateur), récolter le surnageant viral et filtrer à l'aide d'un filtre de 0,45 um. Chargez le surnageant filtré dans le mur 32.5 tubes d'ultracentrifugation ml d'épaisseur, sceller avec du parafilm et centrifuger à 50000 xg, 4 ° C pendant 90 min. Soigneusement remettre le culot dans 50 ul ou un volume approprié de PBS ou HBSS en fonction de l'application.

5. Immuniser des souris in vivo et analyser la réponse immunitaire spécifique de l'antigène

1. Produire des virus à titre élevé, comme décrit dans la section 4.
2. Injecter des souris BALB / c (6-8 semaine, femelle) par une voie plantaire avec la suspension de vecteur (25 pi par talon).
3. 2 semaines après la vaccination, isoler la rate et les cellules spléniques de récolte. splénocytes de culture avec épitopes peptides GFP et d'analyser la présence de GFP spécifique lymphocytes T CD8 ⁺ en utilisant la coloration des cytokines intracellulaires, comme décrit précédemment ¹⁷ (figure 3B).

Résultats

La lignée cellulaire stable décrit dans le présent procédé peut produire de grandes quantités de vecteurs lentiviraux qui sont spécifiquement destinés à des cellules dendritiques. Comme le montre la figure 1B, l'isolement de clones individuels a donné des lignées cellulaires stables de qualité ¹² variables. Parmi les 26 clones testés, 8 produit des particules lentiviraux à un titre de plus de 10 ⁶ unités de transduction par ml (TU / ml), ce qui est une référenc...

Discussion

Ici, nous avons décrit une méthode pour produire de grandes quantités de vecteurs lentiviraux utilisant des cellules 293T stable transduites avec tous les composants lentiviraux sous la tet off système de réglementation. À ce jour, la plupart des protocoles pour produire des vecteurs lentiviraux reposent sur ​​la transfection transitoire de phosphate de calcium standard (voir ^18, par exemple). Cette approche a été couronnée de succès sur une échelle clinique, mais elle peut souffrir de certaine...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Mediatech Inc.	10-013-CV
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Mediatech Inc.	25-005-Cl
Doxycycline	Clontech Laboratories, Inc.	631311
Zeocin	Invitrogen	R250-01	Toxic
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506