Una linea cellulare tetraciclina regolata produce vettori lentivirali ad alto titolo che si rivolgono specificamente cellule dendritiche

Riepilogo

Qui, usiamo trasduzione retrovirale e trasfezione concatemeric per creare una linea cellulare che può esprimere le componenti di un vettore lentivirale (LV) in assenza di tetraciclina. Questo LV codifica GFP ed è pseudotyped con una glicoproteina, SVGmu, che è specifico per un recettore sulle cellule dendritiche.

Abstract

Vettori lentivirali (LV) sono un mezzo efficace per la fornitura di materiale genetico di molti tipi di cellule. A causa di problemi di sicurezza associati a questi HIV-1 vettori derivati, la produzione di grandi quantità di volumi logici è impegnativo. In questo lavoro, riportiamo un metodo per produrre alti titoli di LV auto-inattivanti. Abbiamo retrovirally trasdurre il tet-off stabile produttore cella linea GPR per generare una linea cellulare, GPRS, che può esprimere tutti i componenti virali, compresa una cellula dendritica glicoproteina-specifico, SVGmu. Poi usiamo trasfezione del DNA concatemeric trasfezione trasferimento plasmide codificante GFP LV un gene reporter in combinazione con un marcatore selezionabile. Molti dei cloni risultanti possono produrre LV ad un titolo 10 volte più grande di quello che otteniamo con trasfezione transiente. In più, questi virus efficientemente trasdurre cellule dendritiche in vitro e generano una cellula T forte risposta immunitaria all'antigene nostra giornalista. Questo metodo può essere una buona opzione for la produzione di vaccini forti LV-based per gli studi clinici di cancro o di malattie infettive.

Introduzione

Molti sistemi vettore sono stati sviluppati per il trasferimento genico. Vettori basati su lentivirus sono stati tra il sistema virale più comunemente studiate. Questi vettori sono vantaggiose perché possono trasdurre efficientemente sia divisione e non divisione delle cellule ^1, ottenere l'espressione a lungo termine a causa di integrazione nel genoma dell'ospite, mostrare bassa immunità anti-vettore naturale nella maggior parte delle popolazioni umane ^2, e hanno un basso potenziale di genotossicità di mutagenesi inserzionale ^3,4.

Produzione di lentivirus è sempre stata colorata da preoccupazioni di sicurezza. Vettori lentivirali derivano generalmente da HIV-1, l'agente eziologico dell'AIDS. Trasfezione transiente dei singoli componenti del lentivector (trasferimento, busta e plasmidi di imballaggio) è un mezzo comune e flessibile di fornire materiale genetico in laboratorio. Tuttavia, scaling-up transfezioni transitori per le applicazioni cliniche è ingombrante e may portare allo sviluppo di replicazione-competenti lentivirus ^5,6. Per superare questi ostacoli, vari imballaggio stabile e linee cellulari di produttori sono state sviluppate ^6-11. Una di queste linee, la linea di confezionamento GPR ^11, ha il vantaggio di essere attraente regolato dalla tetraciclina. In questo lavoro, dimostriamo come adattare questo sistema per la produzione di auto-inattivanti vettori lentivirali che sono specificamente indirizzate verso le cellule dendritiche (DC-VL) ^12.

Le cellule dendritiche (DC) sono le più robuste cellule presentanti l'antigene del sistema immunitario. Essi sono stati oggetto di grande interesse per lo sviluppo di vaccini cancro perché essi avviano direttamente, programmi, e regolano le risposte immunitarie tumore-specifici ^13. Inserimento di un protocollo di vaccinazione per includere PVS ha il potenziale di provocare una risposta immunitaria antitumorale forte di peptide o DNA vaccini. Recentemente, abbiamo sviluppato un vettori lentivirali che specifically obiettivi di cellule dendritiche attraverso un Sindbis modificato virus glicoproteina, SVGmu ^14. Questi vettori sono unici nel senso che mostrano elevata specificità per le cellule dendritiche e di generare risposte immunitarie più forti che non specifici, vettori VSVG-pseudotyped.

Qui riportiamo un metodo per produrre grandi quantità di questi vettori lentivirali DC-mirati. Dimostriamo che questi DC-LV può infettare cellule dendritiche e generare forti CD8 ⁺ risposta immunitaria delle cellule T. Tutte le procedure che coinvolgono animali sono stati eseguiti con umanità, con l'approvazione della USC istituzionale dell'Ateneo cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa. Per svolgere esperimenti in vivo e clinici, è fondamentale per creare una linea cellulare che può produrre virus ad un alto titolo. Di eseguire la procedura di trasduzione e trasfezione esattamente come descritto consentirà di massimizzare le probabilità di generare una tale clone.

Protocollo

DC-LV cellule produttori stabili sono costruite sulla base della confezione cella linea ¹¹ GPR che contiene la necessaria componenti lentivirale gagpol, rev e il sistema tet-off. Prima, trasduzione retrovirale viene utilizzato per generare una linea cellulare di packaging GPRS che codifica un tet-dipendente SVGmu glicoproteina. Poi, concatemer matrice trasfezione è usato per trasfettare la linea cellulare GPRS con un vettore lentivirale come transgene GFP. Questa linea cellulare stabile produttore, designato come LV-MGFP, può essere testato in vitro e in vivo per la sua capacità di produrre un vaccino DC-LV contro GFP.

1. Generazione di un Tet-dipendente SVGmu Cell Line

Plasmide PRX-SVGmu è un costrutto in cui DC-specifico SVGmu glicoproteina è clonato a valle del promotore tTA-avanzata di plasmide retrovirale pRetroX-Tet-off ¹ (Figura 1C). Cultura 293T cellule in D10 (medium di Eagle modificato da Dulbecco con10% di siero fetale bovino, 2 mM L-glutammina). Coltura GPR linea cellulare di packaging in D10 con doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 mg / ml). Tutte le cellule sono coltivate in un umidificata 37 ° C incubatore con il 5% di CO _2.

1. 16-18 hr prima della transfezione transiente, piastra 2 x 10 ⁶ cellule 293T in 4 ml di D10 in un piatto di coltura tissutale a 6 cm in modo che le cellule si avvicinano 90% di confluenza al momento della transfezione.
2. Trasfezione di plasmidi retrovirali: mescolare 100 ml 1,25 M CaCl ₂ soluzione, acqua Milli-Q sterile e seguenti plasmidi: 5 mcg PRX-SVGmu, 2,5 mcg pGag-Pol, 2,5 mcg pVSV-G. Il volume finale è di 500 microlitri. Per un ml polistirolo tubo a fondo rotondo 5, aggiungere 500 microlitri 2X HBS (HEPES 50 mm, 10 mm, 12 mm KCl Destrosio, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na ₂ HPO ₄ * 7H ₂ O, pH 7,05). Aggiungere goccia a goccia la miscela plasmide nel buffer HBS 2X mentre ribolle il buffer energicamente con una pipetta Pasteur di vetro. Dopo aver aggiunto il mixture, continuare spumeggiante per altri 30 sec. Quindi, aggiungere l'intera miscela sulle cellule 293T in colture di 6 cm, e incubare a 37 ° C.
3. 4 ore dopo la transfezione, sostituire attenzione il mezzo nel piatto cultura con 4 ml D10 preriscaldato.
4. Spin infezione: 48 ore dopo la trasfezione, raccolto SVGmu-codifica particelle retrovirali nel surnatante facendo passare il surnatante attraverso un filtro di 0,45 micron. Piastra le cellule di packaging GPR in un piatto da 24 pozzetti con 2 x 10 ⁴ cellule / pozzetto. Aggiungere surnatante filtrato per cellule di packaging GPR nel piatto (2 ml / pozzetto) e cellule centrifugare per 90 min a 1050 xg e 25 ° C. Cambiare mezzo in D10 fresco con doxiciclina (1 ng / ml) dopo spin-infezione (2 ml / pozzetto).
5. 72 ore post-trasfezione, espandere la cultura di cellule trasdotte confezionamento in D10 con doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 ng / ml).
6. Per confermare l'espressione di SVGmu, coltivare le cellule senza doxiciclina per 48 ore. Misurare ex superficiepressione di SVGmu con citometria a flusso utilizzando siero anti-Sindbis. Queste cellule sono designati come GPRS linea cellulare di packaging.

2. Costruire DC-LV Produttore Cells da Concatemer Array Transfezione

Lentiviral trasferimento plasmide TL20-GFP è una auto-inattivanti lentivirali trasferimento plasmide vettore sulla base di pCL20c-MSCV-GFP con un sistema di Dox-regulatable virale RNA del genoma espressione e la sostituzione del citomegalovirus (CMV) enhancer con 7 tet operatori (Figura 1C) ^{11 , 12,15.} Plasmide PGK-bile è un resistente (BLE) cassette bleomicina guidato da un debole promotore PGK ^2.

1. Digest 20 mcg TL20-GFP plasmide con l'enzima di restrizione SfiI a 50 ° C. Digest 20 mcg plasmide PGK-bile con PflMI a 37 ° C.
2. Purificare i frammenti di DNA (la cassetta PGK-bile è 1011 bp e il vettore TL20-GFP è 6861 bp) mediante elettroforesi su gel di agarosio.
3. Legare il vettore TL20-GFP e PGK-cassetta bile ad un rapporto molare di 25:1 (NEB DNA ligasi T4). Incubare per una notte a temperatura ambiente.
4. Dopo una notte legatura, purificare il DNA dalla miscela di ligazione (Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit). Garantire la quantità di DNA purificato è di circa 5 mg.
5. 16-18 hr prima della transfezione, le cellule piastra GPRS confezionamento in un piatto di coltura tissutale a 6 cm in modo che la confluenza saranno circa il 90% al momento della transfezione.
6. Utilizzare il metodo di trasfezione fosfato di calcio descritto nel passo 1.2 trasfezione 5 pg di DNA purificato concatemeric nelle cellule confezionamento GPRS nel piatto di coltura tissutale di 6 cm. 4 ore dopo la trasfezione, rimuovere con attenzione il mezzo e sostituirlo con 4 ml D10 pre-riscaldata con doxiciclina (1 ng / ml).
7. 48 ore dopo la trasfezione, cambiare il mezzo in D10 con doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 mg / ml). Seleziona per cloni trasfettati aggiungendo Zeocin (50 mcg / ml) nel mezzo di coltura. Cultura le cellule per circa 2 settimane fino cella Colonies può essere visto sul fondo dei piatti.
8. Etichettare le colonie di cellule sul fondo dei piatti. Prendere 24 pozzetti piatti di coltura di tessuto, il numero dei pozzetti e aggiungere a ciascun pozzetto contenente 2 ml D10 Zeocin (50 mcg / ml), doxiciclina (1 ng / ml), e puromicina (2 mg / ml). Aspirare il terreno delle cellule trasdotte, quindi aggiungere una goccia di tripsina su ciascuna delle colonie per meno di un minuto. Poi, aggiungere una o più gocce di D10 sulle stesse colonie. Prelevare colonie uno ad uno con una pipetta e trasferirli in pozzetti separati della piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti.
9. Cultura e espandere tutti cloni cellulari in D10 contenente Zeocin (50 mcg / ml), doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 mg / ml) per la valutazione della capacità di produzione virale.

3. Valutare virale produzione di ogni clone cellulare

1. Trypsinize le cellule di produttori e piastra in tutto 4x10 ⁶ celle a 6 cm di tessuto cultura piatto in D10 senza doxiciclina tale che la confluenzasupera il 90%. Sostituire il supporto con fresca D10 preriscaldato quotidianamente e raccogliere il supporto per il titolo test 72 ore dopo la rimozione dox.
2. Raccogliere il surnatante virale filtrando il mezzo con un filtro di 0,45 micron.
3. Cellule bersaglio targa che esprime il recettore DC-SIGN (es. 293T.hDC-SIGN o il mouse derivate dal midollo osseo cellule dendritiche ¹⁶⁾ e 293T come controllo negativo in piatti di coltura da 96 pozzetti, 1 x 10 ⁴ cellule / pozzetto. Aggiungere diluizioni seriali di 2 volte del surnatante virale ai pozzetti (100 pl / pozzetto). Solitamente, 6-8 diluizioni sono sufficienti per raggiungere l'intervallo in cui trasdotte cellule GFP-positive sono in un rapporto lineare alla quantità di aggiunta di virus.
4. Centrifugare le cellule e sostituire il mezzo come descritto al punto 1.4. BMDCs dovrebbero essere coltivate in terreno RPMI con 10% di FBS e GM-CSF (01:20 J558L terreno condizionato).
5. Misurare l'espressione di GFP in cellule trasdotte mediante citometria di flusso 4-6 giorni post-trasduzione. Il vecto lentiviralir titolo è calcolata nell'intervallo di diluizione vettore quando la percentuale di cellule GFP-positive e quantità vettoriali sono in una relazione lineare. Scegliere il clone cellulare con la produzione virale più alta per le applicazioni successive.

4. Produrre e Concentrato vettori lentivirali

1. Cultura della linea cellulare produttore (LV-MGFP) in 15 cm di tessuto piatti della cultura.
2. Trypsinize le cellule produttrici e le cellule in piastre da 15 cm piatti coltura di tessuti a più di 90% di confluenza in D10 fresca senza doxiciclina. Cambiare media con fresco D10, preriscaldato quotidiana.
3. Al momento della produzione virale picco (come determinato dall'utente), raccogliere il surnatante virale e filtrare utilizzando un filtro di 0,45 micron. Caricare il surnatante filtrato in spessore parete 32,5 tubi ultracentrifuga ml, sigillare con parafilm e centrifugare a 50.000 xg, a 4 ° C per 90 min. Accuratamente risospendere il pellet in 50 microlitri o un volume appropriato di PBS o HBSS seconda dell'applicazione.

5. Immunizzare topi in vivo e analisi antigene-specifica risposta immunitaria

1. Produrre virus ad alto titolo come descritto nel capitolo 4.
2. Iniettare topi BALB / c (6-8 settimane di età, femmina) attraverso un percorso footpad con il vettore di sospensione (25 microlitri per footpad).
3. 2 settimane dopo l'immunizzazione, isolare milza e splenociti raccolto. Splenociti coltura con GFP peptidi epitopi e analizzare la presenza di GFP-specifiche cellule T CD8 ⁺ mediante colorazione intracellulare delle citochine, come precedentemente descritto ¹⁷ (Figura 3B).

Risultati

La linea cellulare stabile descritto nel presente metodo può produrre grandi quantità di vettori lentivirali mirati specificatamente alle cellule dendritiche. Come mostrato nella Figura 1B, isolamento di cloni individuali ha prodotto linee cellulari stabili di qualità variabile ^12. Tra 26 cloni saggiati, 8 prodotte particelle lentivirali ad un titolo maggiore di 10 ⁶ unità di trasduzione per ml (TU / ml), che è un punto di riferimento tipico per vettori lentivirali SVG-pseudot...

Discussione

Qui, abbiamo delineato un metodo per la produzione di grandi quantità di vettori lentivirali utilizzando 293T cellule trasdotte stabilmente con tutti i componenti lentivirali sotto il tet off sistema di regolamentazione. Ad oggi, la maggior parte dei protocolli per produrre vettori lentivirali basano su standard di trasfezione transiente di calcio fosfato (cfr. ^18, per esempio). Questo approccio ha avuto successo su scala clinico, ma può soffrire di alcune limitazioni che possono non essere presenti in scal...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Mediatech Inc.	10-013-CV
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Mediatech Inc.	25-005-Cl
Doxycycline	Clontech Laboratories, Inc.	631311
Zeocin	Invitrogen	R250-01	Toxic
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506