一个小鼠红细胞亚群富集去核活动由多光谱成像流式细胞仪鉴定

摘要

本协议描述了一种新的识别去核红细胞正色由多光谱成像流式细胞仪，以提供红细胞去核过程的可视化的群体的方法。

摘要

红细胞生成哺乳动物总结了眼球摘除的戏剧性过程，结果在网织红细胞的形成。眼球摘除的机制尚未完全阐明。学习去核红细胞显微镜中的关键蛋白和结构的本地化时遇到的一个常见问题是，观察细胞进行眼球摘除足够数量的难度。我们已经开发了一种新的协议分析使用流量多参数高速细胞成像（多光谱成像流式细胞仪），结合免疫荧光流式细胞仪中，为了确定有效的一个显著号码去核的事件的方法，它允许获得测量和进行统计分析。

首先，我们在这里描述，以便用于同步小鼠红细胞和增加捕获眼球摘除在日的概率两人在体外培养红细胞生成方法评估电子时间。然后，我们详细描述了为了眼球摘除由多光谱成像流式细胞仪过程中，研究细胞内蛋白质或脂质筏的本地化固定和透后红细胞的染色。随着尺寸和它们用来识别正色红细胞DNA/Ter119染色，我们利用在明视场通道，辅助在识别细长细胞和“三角形的质心的XY Ter119/Draq5的小区的参数”纵横比“ “允许的细胞事件，其中TER119染色（新生网织红细胞）的中心相距甚远DRAQ5染色（细胞核进行挤压）的中心，鉴定因而指示一个即将去核细胞。的正色红细胞种群具有高增量的质心和低纵横比的子集被高度富集在去核细胞。

引言

在哺乳动物中红细胞系内终末分化的结论与去核的戏剧性的过程，通过该正色红细胞排出其膜包裹的核^{（pyrenocyte）1，}产生一个网织红细胞^2。这个过程的确切机制，这也是成功的限速步骤，大规模生产的红血细胞在体外 ，还没有完全阐明。去核红细胞内关键的蛋白质和结构的定位依赖于使用荧光显微镜和电子显微镜^3-5。这个繁琐的过程通常会导致的眼球摘除活动数量有限的识别，并且不总是允许有意义的统计分析。扩大对红细胞鉴定麦格拉思等 ⁶前面所述的方法，我们已经开发了一种新的由多光谱伊马确定和研究眼球摘除事件的方法更改流式细胞仪（多参数高速细胞成像中流动，它结合了荧光显微镜与流式细胞术的方法^）7，它可以提供的观测足够数量以获得测量值，并执行统计分析。

在这里，我们描述了前两个在体外培养红细胞生成为了同步红细胞和增加捕获眼球摘除在评估时的概率使用的方法。然后，我们详细描述了为了眼球摘除由多光谱成像流式细胞仪中，研究细胞内蛋白质或脂质筏的本地化固定和透后红细胞的染色。

样品上的成像流运行流式细胞仪和将收集的细胞的门控适当地识别正色红细胞^6。正色红细胞，然后根据它们的纵横比进行分析，测得在明场图像进行更改，对他们的参数增量的质心的XY TER119-DNA，其被定义为分别染色TER119和DNA的区域中，中心之间的距离值。细胞低高宽比和高三角形质心的XY Ter119/DNA的人口是高度浓缩的去核的细胞。用野生型（WT）与红细胞与红细胞的Rac1蛋白在rac2上的Mx-Cre重组酶介导的条件缺失^{- / -}或组合的Rac2 ^{- / -} ; RAC3 ^{- / -}遗传背景和多光谱成像流这种新型分析仪的协议，我们最近表明，眼球摘除类似于非对称细胞分裂，并通过外消旋GTP酶在调节部分的肌动球蛋白环的形成是眼球摘除进展⁷重要。

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研究方案

1，长期体外培养红细胞生成（ 体外红系分化培养议定书Giarratana 等^。8，修改和调整鼠标电池）

这是一个三步骤的长期体外红细胞生成协议。在第一步骤（天0-4）2×10 ⁵个细胞/ ml被放置在补充有干细胞因子（SCF），白细胞介素-3（IL-3），和促红细胞生成素（EPO）的红细胞的生长培养基。在第二步骤（天5-6），将细胞重新悬浮于2×10 ⁵个细胞/ ml和共培养的贴壁基质细胞（MS5）在新鲜红细胞生长培养基中只用Epo的补充。在第三步骤（天7-9），细胞是在一层的MS-5细胞在新鲜红细胞生长培养基的无细胞因子高达摘除术（ 图1A）中培养。

所有动物的协议已获的机构动物护理和使用委员会（IACUC）辛辛那提儿童医院医疗中心。

1. 骨骼和低密度的骨髓细胞中分离的收获
   1. 加入2毫升含在一个15毫升锥形管2％胎牛血清（FBS）的无菌IMDM培养，并保持在冰上。
   2. 安乐死2-6个月大的野生型C57/BL6小鼠（连同或不带基因靶向小鼠的利息）以下机构批准的协议（ 如 CO ₂吸入，颈椎脱位）。
   3. 隔离骨盆骨，股骨，和两条腿的胫骨用钳和手术刀，将它们添加到含IMDM +2％FBS管并保持在冰上。
   4. 加入1 ml IMDM 2％FBS的使用镊子和结核菌素注射器用25克X穿过骨头5/8“针。冲洗IMDM 2％FBS的几次轻轻无菌流式细胞仪管和冲洗骨（通过吸〜500微升的细胞悬浮液，并通过骨再冲洗的话），并收集骨髓细胞进入流cytometrŸ管。法拉盛是完整的骨骼时显示为白色。
   5. 通过在50毫升锥形管的顶部有40微米的细胞过滤设置过滤细胞悬液。用IMDM 2％FBS中，并使用相同的培养基调整细胞悬浮液的最终体积至5ml洗细胞滤网。
   6. 通过密度梯度离心制备的低密度的骨髓细胞（LDBM）：仔细层5毫升细胞悬液上5毫升密度梯度分离细胞的培养基1.083在15-ml管中并旋转，在750×g离心25微克/毫升分钟，在室温（RT）与不加制动/低加速度。
   7. 转移上清液（一切高达约2毫升标记的15-ml的试管中，以获得血沉棕黄层）到一个新的15毫升管中并持续5分钟，在执行多一个洗涤用IMDM 2％FBS中于525×g离心RT。
   8. 吸出上清液，并通过悬浮颗粒在3ml红细胞裂解缓冲液中5分钟，在室温下溶解任何残留的红血细胞（RBC）。如果红细胞的更大的纯度是在（ 例如用于生化研究）的最后一步需要，进一步净化LDBM细胞这一步骤林^负细胞磁分离。
2. 体外红系分化培养协议，从LDBM或林^NEG细胞开始（ 图1A）
   1. 加7毫升IMDM 2％FBS中，自旋在525×g离心5分钟，在室温下，重悬沉淀的细胞在2ml红细胞生长培养基（EGM），其中包括：
      一个。 STEMPRO-34培养基中，含
      湾2.6％STEMPRO-34中型补充，
      角20％BIT-9500，
      ð。 900毫微克/毫升的硫酸亚铁，
      Ë。 90纳克/毫升的硝酸铁，
      f。 100单位/ ml青霉素/链霉素，2mM的L-谷氨酰胺
      克10 ^{-6 M}氢化可的松
      小时。而新加入的细胞因子：
      I）100毫微克/毫升的SCF，
      ⅱ）5毫微克/毫升IL-3，并
      ⅲ）3 IU / ml的促红细胞生成素。
   2. 使用自动细胞计数器或手动在显微镜使用下摆细胞计数ocytometer。
   3. 板在6孔细胞培养板中以5×10 ⁵细胞/孔，以2.5毫升在EGM（2×10 ⁵ LDBM细胞/ ml）的最终体积和孵育在37℃下的浓度（这被认为是如白昼＃文化0）。
   4. 通过吸1.5毫升上清液，纺纱在525×g离心5分钟，在室温下，再悬浮于1.5ml含有所有3种细胞因子和天＃2加回至孔中每天新鲜培养基更换培养基，3，4，以优化增生期。在第3天，取出所有的细胞，计数和分裂成井的适当数量，以维持的〜2×10 ⁵细胞/ ml和细胞浓度。保持文化在37℃/ 5％的CO _2。
   5. 在第4天，板MS5细胞（小鼠基质细胞系），以一个新的细胞培养6孔板的孔中。该MS5细胞培养基α-MEM中含有20％FBS，100单位/ ml青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺。
   6. 第5天，数数细胞（现在在红细胞显著富集）在原始培养板用自动细胞计数器或手动在使用血细胞计数显微镜各孔中。
   7. 解除所有细胞从每个孔中，转移到15毫升锥形管，降速在525×g离心5分钟，在室温，吸出上清液，并溶解粒或仅含有促红细胞生成素（3单位/毫升）以2×10的浓度新鲜EGM ⁵细胞/ ml。
   8. 从其中的MS-5细胞的前一天（针对70-80％汇合在共培养时）镀和添加的类红细胞在这些井在EGM仅含有促红细胞生成素的孔中吸出上清液（虽然不是他们的介质的选择MS-5细胞存活以及在股东特别大会上数天）。
   9. 改变介质上的一天＃6加入新鲜的EPO。
   10. 在一天＃7更改介质，采用临时股东大会没有添加细胞因子。第7天到第9，测试样本为眼球摘除与流量具有抗TER119和祥发，16日及P后流式细胞仪roceed到染色样品的多光谱成像流式细胞术（如第3节详述）。
       注意：电镀前和第2天，4，6，和文化7，流式细胞仪通过评估表面标志CD44和TER119与尺寸（FSC）监测培养细胞为红细胞富集和分化与流动⁹或者CD71，TER119，和FSC也可以用^10，11。

2，快速摘除术含量，据Yoshida 等人描述的协议^。12与修改（图1B）

1. 应激诱导红细胞生成和间质细胞制备方法在体外培养红细胞生成
   1. 每麻醉IACUC准则2-6个月大的野生型C57/BL6小鼠（ 如异氟醚溶液）。确保鼠标已充分通过检查无反射性反应，以温和的后腿爪子捏和麻醉在手术过程中经常呼吸。使用上的眼睛兽医眼药膏，以防止干燥时在麻醉下。
   2. 通过尾部出血的500微升的最终体积诱发应激红细胞生成。使用胰岛素注射器，注射生理盐水等体积腹腔注射，以保证动物的液体复苏（保持在头低脚高位动物注射前和注射于下腹部，以免损伤内脏）。
   3. 请勿将鼠标无人值守，直到它重新获得电机控制的动物开始走动笼，并能够站立和行走没有掉下来表示。该phlebotomized鼠标放置在笼中没有其他小鼠。
   4. 术后第2天，板MS-5细胞在24孔细胞培养板的孔。孵育MS-5细胞在37℃/ 5％CO ₂中MS5细胞培养基（含有20％FBS的α-MEM，100单位/ ml青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺），其目的是为70-80 ％铺满我48小时在n板孔。
2. 脾和脾细胞处理的收获
   1. 应力诱导红细胞生成四天（96小时）后，通过安乐死IACUC批准的协议（ 如 CO ₂吸入颈椎脱位）以前流血鼠标。
   2. 收获脾，把它放在一个15毫升的锥形管的IMDM含2％FBS和保持在冰上。
   3. 早在实验室里，在无菌条件下组织培养罩，反转含脾管上40微米的细胞过滤在50毫升管的顶部设置。用5毫升的塑料注射器的柱塞挤压脾。
   4. 用IMDM 2％FBS冲洗细胞过滤器，并使用相同的培养基，调整细胞悬浮液的最终体积至5ml。
   5. 仔细层上5毫升密度梯度分离细胞的5毫升脾细胞悬浮液介质1.083克/ ml的15毫升管中，自旋，在750×g下在室温下25分钟内，没有制动/低加速度。
   6. 转让上清液（溶液至约2毫升标记的15-ml的试管中，以获得血沉棕黄层）到一个新的15毫升管中，并执行多一个洗涤用IMDM 2％FBS中于525×g离心5分钟，在室温。
   7. 吸出上清液，并裂解红血细胞悬浮的沉淀物在3ml红细胞裂解缓冲液中5分钟，在RT。
   8. 加7毫升IMDM 2％FBS冲洗细胞，并稀释和中和RBC裂解缓冲液和旋在525×g离心5分钟，在4℃下
   9. 吸出上清液，并暂停沉淀的细胞在2毫升红细胞生长培养基（EGM）的。
3. 孤立的低密度脾，富含红细胞，塑料（快速体外培养红细胞生成的第一阶段）文化
   1. 依靠自动细胞计数器或手动血球细胞。细胞中分离每脾在这个阶段的通常数量为〜15×10 ^6。
   2. 暂停细胞进一步在EGM含有细胞因子（在fINAL浓度）：SCF 50 ng / ml的IL-3 5毫微克/毫升，并生成素2单位/毫升。
   3. 板1-5×10 ⁶个细胞在24孔细胞培养板的1毫升/井（同每孔取决于细胞总数数量的细胞）的最终体积，并培育O / N在37℃/ 5％的CO _2。
4. 对MS5细胞红细胞（快速体外培养红细胞生成第二阶段的文化
   1. 从塑料以及抽吸上清液，并加入2毫升冷的10mM EDTA的PBS中5分钟，在冰上到每个孔中抬起细胞（高度浓缩的红细胞）。
   2. 把细胞在新管，在股东特别大会上洗一次（无细胞因子），并悬浮在相同的。
   3. 板^5×10 5 -1×10 ⁶个细胞在1-2毫升的量到各MS5细胞涂于24孔板中的井。如果药理抑制剂在实验中被使用，现在加上他们在适当的浓度。
   4. 孵育6〜8小时（时间由导游显微镜观察未处理的野生型样品中约30％-40％去核）的。红细胞的到MS-5细胞的结合加速其摘除术。
   5. 通过加入2ml冷PBS +的10mM的EDTA，5分钟，在冰上从每个孔中抬起细胞。随着红细胞，MS-5细胞也将被收集，但这些可以稍后在流式细胞仪分析FSC ^喜 TER119轻易排除^-细胞。
   6. 在这个阶段中，细胞可以是固定的和染色的由多光谱成像流式细胞仪分析。

3，红细胞的染色对细胞内蛋白质或脂筏的本地化过程中摘除由多光谱成像流式细胞仪

1. 在PBS中洗涤细胞，旋转525×g离心5分钟，在RT和吸出上清液。
2. 通过重悬细胞沉淀中加入500μl在PBS中的3.7％甲醛15分钟，固定细胞（取决于抗固定的时间可能会发生变化根被探测），并轻轻吹打。
3. 转移到1.5毫升的塑料离心管中并孵育15分钟，在RT。
4. 旋转的长凳上，离心2000×g离心20秒，吸出上清液，加入500微升PBS以每管和移液轻轻地执行一个洗。
5. 旋转的长凳上，离心2000×g离心20秒，吸出上清液并保持在冰上管至少15分钟。 Permeablization步骤3.6-3.9应迅速和有效地完成，并在室温下旋转/抽吸，细胞沉淀应立即放回冰，为了使细胞更好地保持其完整性。
6. 取丙酮溶液从-20°C冰箱装上冰水。在500微升冰冷的50％丙酮（1:1 DH ₂ O）和移液轻轻重悬首细胞沉淀通透细胞。
7. 旋上板凳离心2,000 xg下在500微升20秒，吸出上清，重悬细胞沉淀60，冰冷的100％丙酮轻轻吹打。
8. 旋上板凳离心2000×g离心20秒，吸出上清，重悬细胞沉淀再一次在500微升冰冷的50％丙酮轻轻吹打。
9. 旋上板凳离心2000×g离心20秒，吸出上清液，轻轻吹打在寒冷的FACS缓冲液（PBS +0.5％BSA）洗细胞一次。
10. 准备贴标鸡尾酒抗体或标记感兴趣的分子：0.1 U/100微升AF488-鬼笔环肽对F-肌动蛋白染色和1μl/100微升TER119-PECy7为红系细胞染色。替代的或附加的染色，也可使用AF-488-抗β-微管蛋白抗体（1:50），AF-594标记的霍乱毒素B亚单位标记脂质筏（1:200），抗pMRLC（Ser19）做对于磷酸化肌球蛋白调节轻链（1:50），其次是抗兔AF-488标记的二抗（1:400）和抗-γ-徒步鞋初级抗体林初级兔抗体（1:100），接着加入抗兔AF-555标记的二抗（1:300）。
11. 下面上清吸出，重悬细胞沉淀中加入100μl标记的鸡尾酒，吸管轻轻孵育在室温30分钟。
12. 制备含核染色DRAQ5 2.5微米FACS缓冲液中。
13. FACS缓冲液洗涤细胞，降速板凳上的离心2000×g离心20秒，吸出上清，重悬在含有DRAQ5 60微升FACS缓冲液中。
14. 在摄像运行样品流式细胞仪收集每个实验至少10,000个事件，补偿的原始数据文件如先前公布的^13，和如图2分析结果，使用分析软件特有的成像流式细胞仪。

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结果

首先，电池是基于他们的明场长宽比（他们的未成年子女与他们的长轴长度之比）和明场区（指示其规模大小）进行分析。具有比20一个明视场角值的情况下和高于200事件大多是碎片和细胞聚集体，分别与被排除在分析（ 图2A）。单细胞（门“R1”），然后分析了基于他们对梯度RMS参数，它表示图像的锐度值。门“R2”是创建一个包含细胞与梯度RMS值超过了50 ^个百分位，以选择...

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讨论

近年来红细胞去核的研究已经获得了越来越多的动力，因为它是在步骤在体外红细胞生成培养物是最困难的，以实现成功的，大规模生产的红血细胞在体外有效地重现。直到最近，红细胞去核的研究主要是利用荧光显微镜和流式细胞仪的方法。荧光显微镜的方法，虽然在确定参与分子有帮助的，需要显微镜观察，以确定一个小数目正色红细胞数百个细胞固定于在特定时间点内进行眼?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
αMEM medium	CellGro	15-012-CV
IMDM medium	Hyclone (Thermo Scientific)	SH30228.01
Stempro-34 SFM	GIBCO (Life Tech)	10640
Stempro-34 nutrient supplement	GIBCO (Life Tech)	10641-025
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	512450
BIT9500	Stemcell Technologies	09500
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP-1600-100
Phosphate buffered saline (PBS)	Hyclone (Thermo Scientific)	SH30028.02
Penicillin/Streptomycin	Hyclone (Thermo Scientific)	SV30010
L-glutamine	Hyclone (Thermo Scientific)	SH30590.01
Isothesia (Isoflurane)	Butler-Schein	029405
Histopaque 1.083 mg/ml	Sigma	10831
BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)	BD Biosciences	555899
Acetone	Sigma-Aldrich	534064
Formaldehyde	Fisher Scientific	BP 531-500
Hydrocortisone	Sigma	H4001
Stem Cell Factor (SCF)	Peprotech	250-03
Interleukin-3 (IL-3)	Peprotech	213-13
EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)	AMGEN	available by pharmacy
CD44-FITC antibody	BD Pharmingen	553133
CD71-FITC antibody	BD Pharmingen	553266
Ter119-PECy7 antibody	BD Pharmingen	557853
Phalloidin-AF488	Invitrogen (Life Technologies)	A12379
β-tubulin-AF488 antibody	Cell Signaling	#3623
anti-rabbit AF488-secondary antibody	Invitrogen (Life Technologies)	A11008
anti-rabbit AF555-secondary antibody	Invitrogen (Life Technologies)	A21428
AF594-cholera toxin B subunit	Invitrogen (Life Technologies)	C34777
pMRLC (Ser19) antibody	Cell Signaling	#3671
γ-tubulin antibody	Sigma	T-3559
Syto16	Invitrogen (Life Technologies)	S7578
Draq5	Biostatus	DR50200
Ferrous sulfate	Sigma	F7002
Ferric nitrate	Sigma	F3002
EDTA	Fisher Scientific	BP120500
15-ml tubes	BD Falcon	352099
50-ml tubes	BD Falcon	352098
6-well plates	BD Falcon	353046
24-well plates	BD Falcon	351147
Flow tubes	BD Falcon	352008
Tuberculin syringe	BD	309602
Insulin syringe	BD	329461
Syringe needle 25-G 5/8	BD	305122
Capped flow tubes	BD	352058
40-μm cell strainer	BD Falcon	352340
Scalpel (disposable)	Feather	2975#21
FACS Canto Flow Cytometer	BD
ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer	AMNIS (EMD Millipore)
Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up.	AMNIS (EMD Millipore)
Hemavet 950 Cell Counter	Drew Scientific	CDC-9950-002
NAPCO series 8000WJ Incubator	Thermo scientific
Allegra X-15R Centrifuge	Beckman Coulter	392932
Mini Mouse Bench centrifuge	Denville	C0801