Identificazione di un Murine eritroblasto sottopopolazione Enriched in enucleare Eventi da Multi-spettrale Imaging Citometria a Flusso

Diamantis G. Konstantinidis; Suvarnamala Pushkaran; Katie Giger; Stefanos Manganaris; Yi Zheng; Theodosia A. Kalfa

doi:10.3791/50990

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Method Article

Identificazione di un Murine eritroblasto sottopopolazione Enriched in enucleare Eventi da Multi-spettrale Imaging Citometria a Flusso

DOI:

10.3791/50990

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June 6th, 2014

Diamantis G. Konstantinidis¹, Suvarnamala Pushkaran¹, Katie Giger¹, Stefanos Manganaris², Yi Zheng¹, Theodosia A. Kalfa¹

¹Cancer and Blood Diseases Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, University of Cincinnati College of Medicine, ²IBM

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Riepilogo

Il presente protocollo descrive un nuovo metodo di identificazione di una popolazione di enucleare eritroblasti ortocromatiche dal flusso di imaging multispettrale citometria, fornendo una visualizzazione del processo di enucleazione eritroblasti.

Abstract

Eritropoiesi nei mammiferi si conclude con il drammatico processo di enucleazione che si traduce nella formazione dei reticolociti. Il meccanismo di enucleazione non è stato ancora completamente chiarito. Un problema comune riscontrato quando si studia la localizzazione delle proteine chiave e strutture all'interno erythroblasts enucleare mediante microscopia è la difficoltà di osservare un numero sufficiente di cellule in fase di enucleazione. Abbiamo sviluppato un protocollo di analisi romanzo utilizzando multiparameter imaging cellulare ad alta velocità del flusso (Multi-Spectral Imaging citometria a flusso), un metodo che combina microscopia a immunofluorescenza con citometria a flusso, al fine di individuare in modo efficiente un numero significativo di eventi enucleare, che permette di ottenere misure ed eseguire analisi statistiche.

Per prima cosa descriviamo qui due vitro l'eritropoiesi metodi di coltura in utilizzati per sincronizzare erythroblasts murini e aumentare la probabilità di catturare l'enucleazione al secoloe momento della valutazione. Poi, si descrive in dettaglio la colorazione degli eritroblasti dopo la fissazione e permeabilizzazione per studiare la localizzazione delle proteine intracellulari o raft lipidici durante l'enucleazione dal flusso di imaging multispettrale citometria. Insieme con dimensioni e DNA/Ter119 colorazione che vengono utilizzati per identificare gli eritroblasti ortocromatiche, utilizziamo i parametri "rapporto" di una cella nel canale in campo chiaro che aiuta nel riconoscimento delle cellule allungate e "delta baricentro XY Ter119/Draq5 "che permette l'identificazione di eventi cellulari in cui è molto distanti dal centro di DRAQ5 colorazione (nucleo fase di estrusione) al centro di Ter119 colorazione (reticolociti nascente), indicando così una cella per enucleate. Il sottoinsieme della popolazione ortocromatica eritroblasto con l'alta baricentro delta e basso rapporto d'aspetto è altamente arricchito in enucleare cellule.

Introduzione

Differenziazione terminale all'interno della linea eritroide nei mammiferi si conclude con il drammatico processo di enucleazione, attraverso il quale il eritroblasti ortocromatica espelle suo nucleo membrana-incassato (pyrenocyte) ^1, generando un reticolociti ^2. L'esatto meccanismo di questo processo, che è anche il fattore limitante di successo, su larga scala, la produzione di globuli rossi in vitro, non è ancora completamente chiarito. La localizzazione di proteine chiave e strutture all'interno eritroblasti enucleare si basa sull'utilizzo di microscopia a fluorescenza ed elettronica ^3-5. Questo processo....