זיהוי של subpopulation מועשר Murine Erythroblast באירועי Enucleating ידי Multi-רפאים הדמיה תזרים cytometry

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חדשה לזיהוי אוכלוסייה של enucleating erythroblasts אורתוכרומטי ידי זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry, מתן להדמיה של תהליך אנוקלאציה erythroblast.

Abstract

Erythropoiesis ביונקים מסתיים בתהליך הדרמטי של אנוקלאציה כי תוצאות היווצרות reticulocyte. המנגנון של אנוקלאציה טרם הובהר במלואו. בעיה נפוצה נתקלה כאשר לומדים את הלוקליזציה של חלבונים ומבני מפתח בתוך erythroblasts enucleating ידי מיקרוסקופ היא הקושי לצפות במספר מספק של תאים עוברים אנוקלאציה. פיתחנו פרוטוקול ניתוח חדשני באמצעות הדמיה multiparameter במהירות גבוהה תא בזרימה (Multi-Spectral Imaging cytometry הזרימה), שיטה המשלבת מיקרוסקופיה immunofluorescent עם cytometry זרימה, על מנת לזהות ביעילות מספר משמעותי של אירועי enucleating, המאפשר ל להשיג מדידות וביצוע ניתוחים סטטיסטיים.

אנחנו הראשונים מתארים כאן שתי שיטות מבחנה התרבות בerythropoiesis משמשות כדי לסנכרן erythroblasts העכברי ולהגדיל את ההסתברות ללכידת אנוקלאציה בהזמן דואר של הערכה. לאחר מכן, אנו מתארים בפירוט את ההכתמה של erythroblasts לאחר הקיבוע וpermeabilization כדי ללמוד את הלוקליזציה של חלבונים תאיים או רפסודות שומנים בדם במהלך אנוקלאציה ידי זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry. יחד עם גודל ומכתים DNA/Ter119 אשר משמשים כדי לזהות את erythroblasts אורתוכרומטי, אנו מנצלים את הפרמטרים "יחס" של תא בערוץ הבהיר השדה שמסייע בזיהוי של תאים מוארכים ו" centroid דלתא XY Ter119/Draq5 "המאפשר זיהוי של אירועים הסלולר שבמרכז מכתים Ter119 (reticulocyte המתהווה) הוא רחוק אחד מהשני מהמרכז מכתים Draq5 (שיחול גרעין עובר), ובכך מצביע על תא עומד enucleate. קבוצת המשנה של אוכלוסיית erythroblast אורתוכרומטי עם centroid דלתא גבוה ויחס נמוך מועשר בenucleating תאים.

Introduction

בידול מסוף בתוך שושלת erythroid ביונקים מסתיים בתהליך הדרמטי של אנוקלאציה, שדרכו erythroblast אורתוכרומטי מגרש הגרעין שלה, עטוף בממברנה (pyrenocyte) ^1, שהניבו reticulocyte ^2. המנגנון המדויק של תהליך זה, שהוא גם הגבלת צעד שיעור מוצלח, בקנה מידה גדולה, ייצור כדוריות דם אדומים במבחנה, עדיין לא הובהר במלואו. הלוקליזציה של חלבונים ומבני מפתח בתוך erythroblasts enucleating מסתמכת על השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרוני ^3-5. תהליך מייגע זה בדרך כלל תוצאות בזיהוי של מספר מצומצם של אירועי אנוקלאציה ולא תמיד מאפשר ניתוח סטטיסטי משמעותי. הרחבת על שיטה של זיהוי erythroblast תוארה בעבר על ידי McGrath et al. ^6, פיתחנו גישה חדשנית של זיהוי ולימוד אירועי אנוקלאציה ידי Multi-Spectral אמאגינג cytometry הזרימה (multiparameter הדמיה במהירות גבוהה תא בזרימה, בשיטה המשלבת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם cytometry זרימה) ^7, אשר יכול לספק מספר מספיק של תצפיות כדי להשיג מדידות וביצוע ניתוחים סטטיסטיים.

כאן, אנו מתארים שתי שיטות מבחנה הראשונות בerythropoiesis תרבות משמשות כדי לסנכרן erythroblasts ולהגדיל את ההסתברות ללכידת אנוקלאציה בעת ההערכה. לאחר מכן אנו מתארים בפירוט את ההכתמה של erythroblasts לאחר הקיבוע וpermeabilization כדי ללמוד את הלוקליזציה של חלבונים תאיים או רפסודות שומנים בדם במהלך אנוקלאציה ידי זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry.

דגימות מנוהלות על זרימת הדמיה cytometer והתאים שנאספו הם מגודרים כראוי לזהות erythroblasts אורתוכרומטי ^6. אז erythroblasts אורתוכרומטי מנותחים המבוסס על היחס שלהם, כפי שהיא נמדדת בהר"י brightfieldגינג, לעומת ערכם לcentroid דלתא פרמטר XY Ter119-DNA, אשר מוגדר כמרחק בין המרכזים של האזורים המוכתמים עבור Ter119 ו-DNA, בהתאמה. האוכלוסייה של תאים עם יחס נמוך וcentroid דלתא הגבוה XY Ter119/DNA היא מועשר בenucleating תאים. באמצעות wild-type (WT) erythroblasts לעומת erythroblasts עם מחיקת MX-Cre בתיווך מותנית של Rac1 על Rac2 ^{- / -} או בשילוב Rac2 ^{- / -;} Rac3 ^{- / -} רקע גנטי ופרוטוקול ניתוח הרומן הזה של זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry, אנחנו הוכיחו לאחרונה כי אנוקלאציה דומה cytokinesis סימטרי וכי היווצרות טבעת actomyosin מוסדרת בחלקו על ידי GTPases RAC היא חשובה להתקדמות אנוקלאציה ^7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. לטווח ארוך במבחנה erythropoiesis התרבות (Ex vivo erythroid בידול תרבות פרוטוקול על ידי Giarratana et al. ^8, השתנה והותאם לתאי עכבר)

זה לטווח ארוך 3 שלבים בפרוטוקול erythropoiesis מבחנה. בשלב הראשון (ימים 0-4) 2 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר ממוקמים במדיום גידול erythroblast השלים עם גורם תאי גזע (SCF), interleukin-3 (IL-3), ואריתרופויאטין (EPO). בשלב השני (הימים 5-6), תאי resuspended ב2 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר ושיתוף תרבותי בתאים חסיד סטרומה (MS5) במדיום גידול erythroblast טרי בתוספת רק ב-EPO. בשלב השלישי (ימים 7-9), תאים בתרבית על שכבה של MS-5 תאים במדיום גידול erythroblast טרי ללא ציטוקינים עד אנוקלאציה (איור 1 א).

כל הפרוטוקולים בבעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) שלהמרכז הרפואי בית החולים לילדים בסינסינטי.

1. קציר של עצמות ובידוד של תאי מח עצם בצפיפות נמוכה
   1. הוסף 2 מיליליטר IMDM סטרילי המכיל 2% בסרום שור העובר (FBS) בצינור חרוטי 15 מ"ל ולשמור על קרח.
   2. להרדים עכבר C57/BL6 סוג בר בן 2-6 חודשים (יחד עם או בלי עכבר גנטי ממוקד של עניין) בעקבות פרוטוקול שאושר על מוסד (לדוגמא CO משאיפת _2, ואחריו נקע בצוואר הרחם).
   3. לבודד את עצמות אגן, עצמות ירך, וtibiae של שני רגליו באמצעות מלקחיים ואזמל, להוסיף אותם לצינור המכיל FBS +2% IMDM ולשמור על קרח.
   4. הוספת FBS +2% IMDM 1 מיליליטר בשפופרת סטרילית זרימת cytometry ועצמות סומק באמצעות מלקחיים ומזרק טוברקולין עם x 25-G FBS +2% "מחט 5/8. IMDM פלאש דרך העצמות כמה פעמים בעדינות ( על ידי aspirating ~ 500 μl מהשעית התא ושטיפתו שוב דרך העצם), ולאסוף את תאי מח עצם לתוך זרימת cytometrצינור y. פלאשינג יושלם כאשר עצמות מופיעות לבנה.
   5. סנן תא השעיה באמצעות מערכת מסננת תא 40-מיקרומטר על גבי צינור חרוטי 50 מ"ל. שטוף מסננת תא עם IMDM FBS +2% ושימוש באותו המדיום להתאים נפח סופי של השעיה תא 5 מיליליטר.
   6. הכן את התאים בצפיפות נמוכה מח עצם (LDBM) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות: שכבה בזהירות 5 מיליליטר של תאי השעיה על 5 מיליליטר של הפרדת תא שיפוע צפיפות גרם / מיליליטר בצינור 15 מ"ל וספין ב750 XG במשך 1.083 בינוני 25 דקות בטמפרטורת חדר (RT) ללא האצה בלם / נמוך.
   7. ההעברה supernatant (הכל עד כ סימן 2 מ"ל של צינור 15 מ"ל על מנת לרכוש מעיל באפי) לצינור 15 מיליליטר חדש ולבצע שטיפה יותר אחד עם FBS +2% IMDM ב525 XG במשך 5 דקות ב RT.
   8. לשאוב supernatant וlyse כל תאים הנותרים דם אדום (RBC) על ידי השעיית גלולה ב 3 מיליליטר חיץ תמוגה RBC למשך 5 דקות ב RT. אם טוהר רב יותר של erythroblasts הואנדרש בשלב האחרון (למשל למחקרים ביוכימיים), לטהר תאי LDBM נוספים בשלב זה לתאי ^נג לין ידי הפרדה מגנטית.
2. Vivo לשעבר פרוטוקול תרבות בידול erythroid החל מLDBM או תאי ^נג לין (איור 1 א)
   1. FBS +2% הוסף 7 מיליליטר IMDM, ספין ב525 XG במשך 5 דקות ב RT ו resuspend תאי pelleted ב2 בינוני מיליליטר צמיחת erythroblast (EGM), בהיקף של:
      . בינוני StemPro-34, המכיל
      ב. 2.6% StemPro-34 תוספת בינונית,
      ג. 20% BIT-9500,
      ד. 900 סולפט ברזלי מיליליטר / ng,
      דואר. 90 חנקה ברזל מיליליטר / ng,
      ו. 100 יחידות / פניצילין / סטרפטומיצין מיליליטר, L-גלוטמין 2 מ"מ
      גרם. 10 ^-6 הידרוקורטיזון M
      שעות. והוסיף טרי ציטוקינים:
      i) 100 ng / ml SCF,
      ii) 5 ng / ml IL-3, ו
      iii) 3 IU / ml Epo.
   2. ספירת התאים באמצעות מונה תא אוטומטי או באופן ידני במיקרוסקופ באמצעות אמרהocytometer.
   3. צלחת בצלחת תרבית תאי 6 גם בריכוז של 5 x 10 ⁵ תאים / גם לנפח סופי של 2.5 מיליליטר בEGM (2 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר LDBM) ו לדגור על 37 ° C (זה נחשב כמו יום # 0 של תרבות).
   4. שנה בינונית על ידי aspirating 1.5 מיליליטר של supernatant, מסתובב ב525 XG במשך 5 דקות ב RT, resuspending ב1.5 מיליליטר של מדיום טרי המכיל את כל 3 ציטוקינים והוספה חזרה לבארות בכל יום בימים # 2, 3, 4, כדי לייעל את שלב שגשוג. ביום 3, להסיר את כל התאים, לספור והתפצל למספר מתאים של בארות כדי לקיים ריכוזי תא היטב של ~ 2 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר. לשמור על התרבות ב37 ° C / 5% CO _2.
   5. ביום 4, תאי MS5 הצלחת (קו תאי סטרומה עכברי) לבארות של צלחת 6 היטב תרבית התאים חדשה. מדיום תרבית תאי MS5 הוא α-ממ מכיל FBS 20%, 100 יחידות / פניצילין / סטרפטומיצין מיליליטר, ו -2 L-גלוטמין מ"מ.
   6. ביום 5, לספור מספרתאים (כיום מועשר באופן משמעותי בerythroblasts) בבאר כל צלחת התרבות המקורית באמצעות מונה תא אוטומטי או באופן ידני במיקרוסקופ באמצעות hemocytometer.
   7. הרם את כל התאים מכל טוב ולהעביר לצינורות חרוטי 15 מ"ל, ספין למטה ב525 XG במשך 5 דקות ב RT, לשאוב supernatant ו לפזר פתיתים עם EGM טריות המכילה רק EPO (3 IU / ml) לריכוז של 2 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר.
   8. לשאוב supernatant מהבארות שבו MS-5 תאים היו מצופים ביום הקודם (ממוקד לconfluency 70-80% בזמן של התרבות המשותפת) ולהוסיף תאי erythroid בבארות אלה בEGM מכילה רק EPO (אם כי לא המדיום שלהם בחירה, MS-5 תאים לשרוד גם בEGM במשך כמה ימים).
   9. שנה בינונית הוספת EPO הטרי ביום # 6.
   10. שנה בינונית ביום # 7, תוך שימוש בEGM ללא ציטוקינים הוסיפו. בימים 7 עד 9, דגימות מבחן לאנוקלאציה עם cytometry זרימה לאחר צביעה עם אנטי Ter119 וSyto-16 יומית ו-proceed למכתים את הדגימות לMulti-Spectral Imaging cytometry הזרימה (כמפורט בסעיף 3).
       הערה:. לפני ציפוי וביום 2, 4, 6, ו -7 של תרבות, לפקח על תאים בתרבית להעשרת erythroblast והבחנה עם cytometry זרימה על ידי הערכת סמני משטח CD44 וTer119 לעומת הגודל (FSC) ⁹ לחלופין CD71, Ter119, וFSC יכול לשמש גם ^{10, 11.}

2. Enucleation Assay המהיר, על פי הפרוטוקול שתואר על ידי יושידה et al. ¹² עם שינויים (איור 1)

1. אינדוקציה erythropoiesis מתח וstroma הכנת תא לתרבות erythropoiesis במבחנה
   1. הרדימי עכבר ישן 2-6 חודש סוג בר C57/BL6 להנחיות IACUC (לדוגמא עם פתרון isoflurane). ודא שהעכבר כבר מורדם כראוי על ידי בדיקה על היעדרות של תגובות רפלקסיביות לקמצוץ האחורי-כפה עדין ועבורנשימתו הסדירה במהלך ההליך. השתמש במשחת עיני וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
   2. לגרום erythropoiesis מתח באמצעות זנב מדמם לנפח סופי של μl 500. שימוש במזרק אינסולין, להזריק נפח שווה של מלח רגיל intraperitoneally כדי להבטיח החייאת נוזלים של החיה (להחזיק בעלי חיים בעמדת Trendelenburg לפני הזרקה ולהזריק בבטן התחתונה, כדי שלא לגרום נזק לאיברים פנימיים).
   3. אל תשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא שב לשליטה מוטורית כפי שצוין על ידי בעלי החיים מתחילים לנוע בכלוב ולהיות מסוגל לעמוד וללכת בלי ליפול. עכבר phlebotomized ממוקם בכלוב בלי עכברים אחרים.
   4. אחרי 2 ימים, צלחת MS-5 תאים בבארות של צלחת תרבית תאי 24 גם. דגירה MS-5 תאים ב37 ° C / 5% CO ₂ במדיום סלולרי MS5 (-ממ מכיל FBS 20%, 100 יחידות / פניצילין / סטרפטומיצין מיליליטר, ו 2 מ"מ L-גלוטמין) במטרה להיות 70-80 % I מחוברותבארות צלחת n לאחר 48 שעה.
2. קציר של טחול ועיבוד של splenocytes
   1. ארבעה ימים (96 hr) אחרי גיוס erythropoiesis המתח, להרדים דימם בעבר עכבר באמצעות פרוטוקול שאושר IACUC (למשל משאיפת CO ₂ ואחריו נקע בצוואר הרחם).
   2. טחול קציר ולשים אותו בצינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל 2% FBS IMDM ולשמור על קרח.
   3. חזרה במעבדה, במכסת המנוע בתרבית רקמה בתנאים סטריליים, להפוך צינור המכיל טחול במסננת תא 40-מיקרומטר נקבע על גבי צינור 50 מ"ל. קראש טחול באמצעות הבוכנה של מזרק פלסטיק 5 מ"ל.
   4. שטוף מסננת תא עם FBS +2% IMDM ובאמצעות אותו המדיום, להתאים את הנפח הסופי של השעיה תא 5 מיליליטר.
   5. שכבה בזהירות את ההשעיה splenocyte 5 מיליליטר ב -5 בהפרדת תא מיליליטר צפיפות שיפוע בינוני 1.083 גר '/ מיליליטר בצינור 15 מ"ל וספין ב750 XG במשך 25 דקות ב RT ללא האצת בלם / נמוך.
   6. להעבירsupernatant (פתרון למטה על סימן 2 מ"ל של הצינור 15 מ"ל על מנת לרכוש מעיל באפי) לצינור 15 מיליליטר חדש ולבצע שטיפה נוספת עם FBS +2% IMDM ב525 XG במשך 5 דקות ב RT .
   7. לשאוב supernatant ותאי דם אדומים lyse ידי השעיית גלולה ב 3 מיליליטר חיץ תמוגה RBC למשך 5 דקות ב RT.
   8. הוסף 7 IMDM מיליליטר FBS +2% לשטוף תאים ולדלל ולנטרל את מאגר תמוגה RBC וספין ב525 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
   9. לשאוב supernatant ו להשעות תאי טבליות ב2 מיליליטר של מדיום גידול erythroblast (EGM).
3. תרבות של splenocytes המבודד בצפיפות נמוכה, מועשר בerythroblasts, על פלסטיק (השלב ​​הראשון של תרבות erythropoiesis מהירה במבחנה)
   1. ספירת תאים על דלפק תא אוטומטי או באופן ידני על ידי hemocytometer. מספר רגיל של תאים מבודדים לטחול בשלב זה הוא ~ 15 x 10 ^6.
   2. להשעות את התאים נוספים בEGM המכילים ציטוקינים (בfריכוזי inal): SCF 50 מיליליטר ng /, IL-3 5 ng / ml, וEpo 2 U / ml.
   3. פלייט 1-5 x 10 ⁶ תאים בנפח סופי של 1 מיליליטר / היטב (אותו מספר של תאים לכל גם בהתאם למספר כולל של תאים) של צלחת תרבית תאי 24 היטב דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס / CO ₂ של 5%.
4. תרבות של erythroblasts על תאי MS5 (שלב שני של תרבות erythropoiesis מהירה במבחנה
   1. לשאוב supernatant מהפלסטיק היטב ולהרים את התאים (מועשרים בerythroblasts) על ידי הוספת 2 מיליליטר של קר 10 mM EDTA ב PBS במשך 5 דקות, על קרח היטב כל אחד.
   2. שים תאים בצינורות טריים, לשטוף פעם בEGM (ללא ציטוקינים) ו resuspend באותו הדבר.
   3. צלחת 5 x x 10 ⁵ -1 10 ⁶ תאים בנפח 1-2 מיליליטר לכל MS5 גם צלחת 24 גם מצופה תא. אם מעכבים תרופתיים נמצאים בשימוש בניסוי, להוסיף אותם בריכוזים מתאימים עכשיו.
   4. דגירה במשך 6 עד 8 שעות (זמן מונחה על ידיתצפית מיקרוסקופית של כ 30% אנוקלאציה -40% במדגם WT שלא טופל). המחייבים של erythroblasts ל-MS-5 תאים מאיץ אנוקלאציה.
   5. הרם תאים מכל גם על ידי הוספת 2 מיליליטר של PBS הקר + 10 mM EDTA, למשך 5 דקות, על קרח. יחד עם erythroblasts, MS-5 תאים יהיו גם נאספו, אך מאוחר יותר ניתן לשלול אלה בקלות במהלך ניתוח תזרים cytometric כTer119 ^היי FSC ^- תאים.
   6. בשלב זה, ניתן לתקן תאים ומוכתמים לניתוח על ידי Multi-Spectral Imaging cytometry הזרימה.

3. הכתמה של Erythroblasts ללוקליזציה של חלבונים תאיים או רפסודות שומנים בדם במהלך Enucleation ידי Multi-רפאים הדמיה תזרים cytometry

1. שטפו תאי PBS, ספין 525 XG במשך 5 דקות ב RT ולשאוב supernatant.
2. תקן את התאים על ידי resuspending כדורי תא ב500 μl של פורמלדהיד .3.7% ב-PBS במשך 15 דקות (זמן קיבוע עשוי להשתנות תלוי באנטידור שחקר) וpipetting בעדינות.
3. העברה לצינורות צנטריפוגה פלסטיק 1.5 מ"ל ו דגירה של 15 דקות ב RT.
4. ספין על XG microcentrifuge ספסל 2,000 ל20 שניות, לשאוב supernatant ולבצע שטיפה אחת על ידי הוספת 500 μl PBS על צינור אחד וpipetting בעדינות.
5. ספין על XG 2,000 microcentrifuge ספסל עבור 20 שניות, לשאוב supernatant ולשמור על צינורות על קרח לפחות 15 דקות. Permeablization צעדים 3.6-3.9 צריכים להיעשות במהירות וביעילות, ובעקבות ספינינג / שאיפה ב RT, צריכים מייד לשים כדורי תא אחורי על קרח, על מנת שתאים כדי לשמור על היושרה שלהם טובים יותר.
6. קח את פתרונות אצטון מ מקפיא -20 מעלות צלזיוס ולשים על קרח. Permeabilize תאים על ידי resuspending כדורי תא הראשון ב500 אצטון μl קר כקרח 50% (1:1 עם DH ₂ O) וpipetting בעדינות.
7. ספין על ספסל microcentrifuge 2,000 XG לכדורי 20 שניות, לשאוב supernatant ותא גלול ב500 μl60; אצטון 100% קרים כקרח על ידי pipetting בעדינות.
8. ספין על ספסל microcentrifuge 2,000 XG לכדורי 20 שניות, לשאוב supernatant ותא גלול פעם נוסף ב500 אצטון 50% קרים כקרח μl ידי pipetting בעדינות.
9. ספין על ספסל microcentrifuge 2,000 XG במשך 20 שניות, לשאוב supernatant ולשטוף את תאי פעם אחת בחיץ FACS הקר (BSA + 0.5% PBS) על ידי pipetting בעדינות.
10. הכן קוקטייל תיוג עם נוגדנים או סמנים למולקולות של עניין: 0.1 U/100 μl AF488-phalloidin לצביעת F-אקטין ו1 μl/100 μl Ter119-PECy7 למכתים תא erythroid. מכתים אלטרנטיבי או נוסף יכול להיעשות גם באמצעות AF-488-אנטי β-טובולין נוגדן (1:50), למקטע רעלן הכולרה B AF-594 מצומדות לתייג רפסודות שומנים בדם (1:200), אנטי pMRLC (Ser19) נוגדן ראשוני לשרשרת שרירן פוספורילציה אור הרגולציה (1:50), ואחריו נוגדנים נגד ארנב AF-488 מצומדות משניים (1:400), ואנטי γ-tubuנוגדן לין ארנב העיקרי (1:100) ואחריו נוגדנים נגד ארנב AF-555 מצומדות המשניים (1:300).
11. בעקבות שאיפת supernatant, resuspend כדורי תא בקוקטייל הסמן, פיפטה 100 μl עדינות דגירה במשך 30 דקות ב RT.
12. הכן את חיץ FACS מכיל 2.5 מיקרומטר של Draq5 הכתם הגרעיני.
13. שטוף תאים בחיץ FACS, ספין למטה על microcentrifuge ספסל 2,000 XG במשך 20 שניות, לשאוב supernatant ו resuspend ב 60 חיץ FACS μl מכיל Draq5.
14. דגימות לרוץ על ההדמיה לזרום cytometer לאסוף לפחות 10,000 אירועים לכל ניסוי, לפצות את קבצי הנתונים הגולמיים ^כ13 שפורסמו בעבר, ולנתח את התוצאות כפי שמוצגות באיור 2, תוך שימוש בתוכנה לניתוח ספציפי להדמית cytometer זרימה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ראשית, תאים מנותחים על בסיס יחס הממדים Brightfield (היחס בין אורכם הקטינים לעומת הציר המרכזי שלהם) ופינת Brightfield (מעיד על הגודל שלהם). אירועים עם ערך פינת Brightfield נמוך מ20 וגבוהים יותר מאשר 200 הם בעיקר אגרגטים פסולת ותאים, בהתאמה, והם נכללים בניתוח (איור 2 א). תאים בודדים (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בשנים האחרונות המחקר של אנוקלאציה erythroblast צבר תאוצה גוברת שכן הוא הצעד במבחנת תרבויות erythropoiesis שהוא קשה ביותר להתרבות ביעילות על מנת להשיג ייצור של תאי דם אדומים לשעבר vivo מוצלח, בקנה מידה גדולה. עד לאחרונה, המחקר של אנוקלאציה erythroblast מנוצל מיקרוסקופיה בעיקר ה?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
αMEM medium	CellGro	15-012-CV
IMDM medium	Hyclone (Thermo Scientific)	SH30228.01
Stempro-34 SFM	GIBCO (Life Tech)	10640
Stempro-34 nutrient supplement	GIBCO (Life Tech)	10641-025
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	512450
BIT9500	Stemcell Technologies	09500
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP-1600-100
Phosphate buffered saline (PBS)	Hyclone (Thermo Scientific)	SH30028.02
Penicillin/Streptomycin	Hyclone (Thermo Scientific)	SV30010
L-glutamine	Hyclone (Thermo Scientific)	SH30590.01
Isothesia (Isoflurane)	Butler-Schein	029405
Histopaque 1.083 mg/ml	Sigma	10831
BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)	BD Biosciences	555899
Acetone	Sigma-Aldrich	534064
Formaldehyde	Fisher Scientific	BP 531-500
Hydrocortisone	Sigma	H4001
Stem Cell Factor (SCF)	Peprotech	250-03
Interleukin-3 (IL-3)	Peprotech	213-13
EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)	AMGEN	available by pharmacy
CD44-FITC antibody	BD Pharmingen	553133
CD71-FITC antibody	BD Pharmingen	553266
Ter119-PECy7 antibody	BD Pharmingen	557853
Phalloidin-AF488	Invitrogen (Life Technologies)	A12379
β-tubulin-AF488 antibody	Cell Signaling	#3623
anti-rabbit AF488-secondary antibody	Invitrogen (Life Technologies)	A11008
anti-rabbit AF555-secondary antibody	Invitrogen (Life Technologies)	A21428
AF594-cholera toxin B subunit	Invitrogen (Life Technologies)	C34777
pMRLC (Ser19) antibody	Cell Signaling	#3671
γ-tubulin antibody	Sigma	T-3559
Syto16	Invitrogen (Life Technologies)	S7578
Draq5	Biostatus	DR50200
Ferrous sulfate	Sigma	F7002
Ferric nitrate	Sigma	F3002
EDTA	Fisher Scientific	BP120500
15-ml tubes	BD Falcon	352099
50-ml tubes	BD Falcon	352098
6-well plates	BD Falcon	353046
24-well plates	BD Falcon	351147
Flow tubes	BD Falcon	352008
Tuberculin syringe	BD	309602
Insulin syringe	BD	329461
Syringe needle 25-G 5/8	BD	305122
Capped flow tubes	BD	352058
40-μm cell strainer	BD Falcon	352340
Scalpel (disposable)	Feather	2975#21
FACS Canto Flow Cytometer	BD
ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer	AMNIS (EMD Millipore)
Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up.	AMNIS (EMD Millipore)
Hemavet 950 Cell Counter	Drew Scientific	CDC-9950-002
NAPCO series 8000WJ Incubator	Thermo scientific
Allegra X-15R Centrifuge	Beckman Coulter	392932
Mini Mouse Bench centrifuge	Denville	C0801