去耦力学传递线索的影响制备羟基聚丙烯酰胺水凝胶的

摘要

我们提出了一个新的聚丙烯酰胺水凝胶，称为羟基聚丙烯酰胺，它允许直接结合ECM蛋白以最小的成本或专业知识。羟基聚丙烯酰胺的结合水凝胶与微接触印刷有利于学习的蜂窝mechanostransduction独立控制的自然细胞微环境的许多线索。

摘要

它已经是公认的，很多细胞功能由细胞与它们的细胞外基质（ECM）的环境中的物理化学和机械线索的相互作用调节。真核细胞中不断地感受到通过表面mechanosensors的局部微环境转导细胞外基质的物理变化成生化信号，​​并将这些信号，实现基因表达的具体变化。有趣的是，ECM可以相互配合物理力学参数来调节细胞的命运。因此，关键是了解机械传导是分离的细胞功能，细胞外基质线索的相对贡献。

在这里，我们提出了一个详细的实验方案，以快速，方便地生成生物相关的水凝胶的机械传导线索体外独立调整。我们化学改性的聚丙烯酰胺水凝胶（聚丙烯酰胺），以克服其内在的非adhes香港专业教育学院通过在聚合过程中掺入羟基官能化的丙烯酰胺单体的特性。我们获得了一种新的聚丙烯酰胺水凝胶，称为羟基聚丙烯酰胺，其允许ECM蛋白的任何所希望的性质的固相化。羟基-聚丙烯酰胺的结合水凝胶与微接触印刷允许独立地控制单细胞的形态，基质硬度的性质和ECM蛋白的密度。我们提供了可以设置在每一个生物实验室体外细胞机械传导过程，研究了一个简单，快捷的方法。我们通过开展对血管内皮细胞表现出细胞外基质的硬度和细胞核之间的机械耦合实验验证了该新型二维平台。

引言

局部细胞微环境的许多方面（ 例如 ，刚度，孔隙大小，蛋白质的性质，或细胞的配体密度）提供坐标设置监管线索控制的细 ​​胞过程，如运动性，细胞增殖，分化和基因表达的影响。的胞外环境中的物理化学性质的修改可以由细胞所感知，并导致不同的生理后果，包括细胞分化，迁移和分化的变形。然而，目前还不清楚，细胞如何转化流脑修改成细胞的生化信号。因此，具有重大意义工程师在体外微环境，可再生的细胞与微环境之间的相互作用来研究机械传导途径的控制，这是。为了解决这个问题，我们最近推出了一种新的方法^1，称为羟基聚丙烯酰胺水凝胶，方便地生成两毛钱nsional软矩阵，允许独立控制重要的机械传导线索：刚度矩阵，单元的几何形状和约束，蛋白质和细胞配体浓度的本质。

ECM指示经由梯度的细胞过程中的形态发生素（趋化性），胶蛋白（趋触），和硬度（durotaxis）。在过去的几十年中，先进的体外平台已经开发了以分离这些细胞外的线索，以便弄清细胞如何能够翻译生物化学和生物物理特性为生理过程^2-5。电子束^6，光刻^7，光化学固定^8，或等离子体辅助的技术⁹已经开发了直接在微图案化基板的活细胞的生长。虽然这些技术已经取得了重要成果，其中大多数是不允许不同的线索对细胞行为的个人影响力之间的歧视他们需要的技术设备，很少有实验室能负担得起。在这些技术中，微接触印刷（μCP），已经成为一个强大的和可访问的方法创建细胞粘着微型岛屿^10。最近，大量努力^11-14已开发μCP上的水凝胶具有可调刚性以再现范围广的活组织中观察到刚性的。在这些作品，聚丙烯酰胺酰胺（PAAm）已成为流行¹⁵和已经是最常用的聚合物为基础的基质细胞的生物力学分析中的一个。

聚丙烯酰胺的表面通常被官能化的异双功能连接基N-磺基琥珀酰亚胺-6 - [4'-叠氮-2'-nitrophenylamido]（磺基SANPAH）和ECM蛋白通过紫外线活化的磺基 - SANPAH硝基苯的链接到表面叠氮基^16。另一种技术包括在耦合肼到已严重氧化蛋白高碘^17。海因德和他的同事介绍了图形化水凝胶仿生表面蛋白质和多肽的技术，需要在光聚合的丙烯酰基-链亲和素单体¹⁸的存在。最近，曾等人已报道基于聚丙烯酰胺的通过光学石英掩模深UV曝光的新图案化方法^19，需要温育活化PA的凝胶用1 -乙基- 3 [3 -二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的水溶液之前添加的蛋白质。尽管这些技术来创建均匀和可再现的蛋白质微图案的能力，其中大多数遭受重大的局限性：长合成过程（ 例如 ，透析，冷冻干燥等），昂贵的化学化合物（ 例如 ，透明质酸，磺基SANPAH）或深紫外线照射。此外，这些技术不允许衬底的刚度，微图案的独立调制几何形状，细胞外基质蛋白的性质，以及细胞 - 配体密度。

考虑到这些限制考虑在内，我们已经开发了一种新的和简单的基于丙烯酰胺的方法，可以让各种软凝胶蛋白质和生物分子的固定化，并允许以破译其对细胞功能的作用，机械传导线索的独立调节。相反，治疗聚丙烯酰胺水凝胶与苛刻的化学化合物，我们引入聚丙烯酰胺聚合过程中的商业丙烯酰胺单体与羟基。这种简单的操作克服了聚丙烯酰胺水凝胶的固有抗粘附性，没有任何其它的技术要求。

羟基基团的存在导致的羟基聚丙烯酰胺水凝胶的形成氢键相互作用的蛋白质和生物分子的亲和性高。与μCP组合，羟基聚丙烯酰胺水凝胶能够迅速生成的二维培养平台与独立控制矩阵的刚性，ECM蛋白的类型，细胞配体密度和密闭的粘附性，其设想是一个强大的平台，学习机械传导。

该协议的目的是提供必要的信息，很容易使羟基聚丙烯酰胺水凝胶在没有材料科学的任何专业知识。最终的目标是提供一种手段，研究人员要求在细胞和组织水平，可能会导致更好的了解所涉及的病理生理机制，机械传导途径的生理有关的问题。

研究方案

1，激活盖玻片的表面

1. 广场的圆形玻璃盖玻片（直径25毫米），在培养皿中，并涂抹上0.1 M的氢氧化钠溶液中5分钟（化学通风柜推荐）。
2. 除去NaOH溶液，充分浸泡盖玻片，用无菌DDH _{2 O}的20分钟，而在无菌培养罩轻轻摇晃在摇板。
3. 排水无菌DDH ₂ O和重复步骤1.2。
4. 用无菌镊子取出盖玻片，并将其放置在一个新的培养皿激活面朝上。
5. 在高纯度氮气源源不断干盖玻片。
6. 在无菌培养罩，涂抹一薄层3（三甲氧基甲硅烷基）丙基丙烯酸酯（92％）在盖玻片的激活边搅拌1小时。
7. 广泛洗盖玻片，用无菌DDH _{2 O} 3清洗和浸泡他们在无菌DDH _{2 O}的一个新的培养皿。
8. 点击培养皿用封口膜，将它放在一个摇杆板下轻轻搅拌10分钟。
9. 删除DDH _{2 O}的盖玻片，用无菌镊子细技巧，并将其放置在一个新的培养皿激活面朝上。
10. 在室温下储存与铝箔干燥的地方，避免灰尘粘在盖玻片。

2，制备羟基聚丙烯酰胺水凝胶的

1. 在1.5ml离心管中准备的65毫克N-羟乙基丙烯酰胺（HEA）的重量。它准备一个新鲜的HEA的解决方案是非常重要的。
2. 加入1毫升50毫米的HEPES缓冲HEA和混合使用涡旋直至完全HEA溶解。
3. 添加40％的400微升w / w的在HEPES丙烯酰胺溶液和2％的所需体积w / w的在HEPES双丙烯酰胺溶液（ 见表1），以达到所需的水凝胶的硬度。用50mM HEPES调整到5毫升的最终体积。
4. 混合使用涡旋和德加它的解决方案在为了降低该溶液中，以防止羟基聚丙烯酰胺聚合中的氧气浓度的真空室20分钟。
5. 在无菌罩，过滤用0.2微米孔径过滤脱气的解决方案，以消毒吧。
6. 在7分钟激活圆形玻璃盖玻片（直径22mm），在紫外线/臭氧清洁。
7. 制备100微升10％过硫酸铵（APS）溶液，即10毫克的APS于100μlDDH ₂ O。它准备一个新鲜的APS解决方案是非常重要的。
8. 加入2.5微升四亚甲基二胺的（TEMED）和25微升的APS溶液的灭菌羟基聚丙烯酰胺溶液（步骤2.5），以引发聚合。混合溶液通过3个连续的移液操作而不引入气泡，在无菌条件下。
9. 在无菌罩，放置在25毫米盖玻片的羟基聚丙烯酰胺溶液的25微升滴（可从步骤1.9），并立即将22毫米GL屁股盖玻片（上制备步骤2.5）在熔滴上的顶端挤羟基聚丙烯酰胺溶液。中心无菌镊子22毫米的玻璃盖玻片和理顺任何气泡。
10. 允许羟基聚丙烯酰胺水凝胶的聚合在室温下进行15分钟。倒置手动剩余羟基的PAAm在Eppendorf管中的溶液，以跟随在完成聚合过程。
11. 完全沉浸在盖玻片，用无菌DDH ₂ O和精心引进的22毫米的玻璃盖玻片和羟基聚丙烯酰胺水凝胶层之间的刀片边缘分离22毫米的玻璃盖玻片。
12. 用无菌PBS洗涤羟基-聚丙烯酰胺凝胶（3往来的PBS中），并让完全沉浸在无菌PBS中，以保持水合的凝胶。
13. 存储羟基-聚丙烯酰胺凝胶在无菌PBS中，在4℃下进行最多3天。

3，聚二甲基硅氧烷（PDMS）Microstamp制造

注：硅大师的制作前站需室温的PDMS microstamp制造。硅掌握此微细可以通过光刻技术，这需要专门的设备和培训来完成。合作与纳米加工设施，鼓励制造硅的主人。另外，联系公司，编造定制微硅主人需求。要注意的是该硅原型的制造中仅需要执行一次是很重要的。事实上，微硅的主人可以无限期使用，产生弹性邮票。

1. 混合的PDMS和10固化剂：1的比例在塑料烧杯中，用吸管10分钟调匀。
2. 在真空下脱气PDMS混合物以除去在步骤3.1中形成气泡。
3. 放置在培养皿中的微芯片主，就可以投出10毫米厚的一层脱气PDMS混合物没有形成气泡。
4. 让固化的PDMS 2小时，在60℃的烤箱。
5. 在无尘的环境中，剥离的PDMS层和消费1厘米² microstamps用手术刀。
6. 使用镊子，地方PDMS microstamps模式，在一个培养皿。

4，微图案羟基聚丙烯酰胺水凝胶

1. 在乙醇/水的地方PDMS microstamps（50/50）溶液并超声处理15分钟。
2. 干燥该邮票用氮气流的流，并将其放置图案式中的UV /臭氧清洁器（λ<200纳米）7分钟。
3. 在无菌罩，放置所需的蛋白质溶液（ 例如 ，100微克/毫升层粘连蛋白的PBS或25微克/毫升纤维连接蛋白的PBS）上的1厘米²的PDMS印章的微结构表面150微升下降。
4. 可选：修改的蛋白质溶液的浓度来调节细胞的配体密度。
5. 通过用移液管的无菌尖端朝向的每个角落移动它分布在印面的蛋白溶液邮票。
6. 离开的蛋白溶液在无菌罩，以吸附于PDMS压模60分钟。关掉灯，以避免蛋白质损坏。
7. 在无菌罩，转让羟基聚丙烯酰胺涂层的盖玻片（可从步骤2.13）到培养皿中。
8. 从羟基聚丙烯酰胺基质的表面，在无菌条件下，低氮流中取出多余的PBS。只要没有证据表明在凝胶表面积水的观察停止该程序。凝胶不应该在这个阶段彻底干燥。
9. 干仔细的PDMS结构表面具有高纯度氮气源源不断的印记。
10. 掌握了穿衣组织钳蛋白包被的邮票，将结构化表面与干凝胶表面接触。申请简要压力点与镊子对PDMS压模的顶部的前端，以保证邮票微特​​征和水凝胶表面之间的良好接触。
11. 离开日的PDMS印章ë水凝胶表面进行1小时，在室温。
12. 轻轻地从羟基聚丙烯酰胺水凝胶取出的PDMS印章用敷料组织钳，并按照4.1的步骤来清洁邮票。
13. 3交流的PBS（pH值为7.4）在无菌条件下，每兑换10分钟广泛洗净加盖羟基聚丙烯酰胺水凝胶。
14. 可选：其它ECM蛋白的其他微图案可通过以下步骤4.5到4.11被添加到羟基的PAAm表面。
15. 钝化非印刷区与BSA的下一个温柔的搅动一摇板的无菌溶液，在5毫克/毫升的PBS在一个晚上，在4℃。
16. 3交流的PBS（pH值为7.4）在无菌条件下，每兑换10分钟大量清洗。在这一阶段，冲压羟基聚丙烯酰胺水凝胶可以被存储在4℃下最多一周。

在微图案化羟基聚丙烯酰胺水凝胶5细胞沉积

1. 在孵育细胞介质盖玻片30-45分钟电镀前çELLS。
2. 在37℃下洗涤贴壁细胞在75cm ²的培养瓶中，用无菌PBS培养并用3ml胰蛋白酶-EDTA的或的Accutase 10分钟分离。
3. 传送的预温热的完全生长培养基中适当的所需量为您的细胞系为含有分离的细胞的烧瓶中，并离心细胞悬浮液3分钟，在650×g下。
4. 除去用微量上清，将细胞重悬于完全培养基中，在15-20,000个细胞/ ml。
5. 加入4毫升的细胞溶液到微图案盖玻片（来自步骤5.1）得到的，然后将细胞覆盖的盖玻片在培养箱中在37℃和5％的湿度下保持1-2小时。
6. 轻轻吸独立的单元，更换培养基。返回的贴壁细胞的培养器，并让他们传播完全（3-6小时，这取决于细胞类型）。

结果

图1A中提出了丙烯酰胺的共聚合（AAM）和双丙烯酰胺（BIS-AAM）用N-羟基乙基丙烯酰胺（HEA）含有无规自由基聚合具有嵌入的羟基形成的聚丙烯酰胺的亲水性网络中的伯羟基的单体（羟基的PAAm） 。在这个协议中，体重65毫克HEA必须稀释在1毫升HEPES的音量。明知HEA的密度约等于1，我们假设我们得到1,065微升（HEA + HEPES）的工作容积。如上述表1所示 ，总加入1065微升至400微升的...

讨论

许多体外观测在现代细胞生物学已在刚性玻璃盖玻片上，常常涂上一层薄薄的细胞外基质蛋白或含RGD序列的合成肽进行的。然而，这样的基本培养基材不重述ECM的整个物理复杂性，因此不用于研究细胞的机械传导过程提供准确的模型。为了解决这个问题，我们提出了一个简单的替代功能化的二维凝胶与任何需要的量和细胞外基质蛋白的性质。此方法允许的重要机械传导线索，如矩阵刚度，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
UV/Ozone Photoreactor	Ultra-Violet Products	Model PR-100
Rocking plate	IKAcWerke	Model KS 130 Basic
Vortexer	Scientific Industries	Model Vortex Genie2
Vacuum degassing chamber	Applied Vacuum Engineering	DP- 8-KIT
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
Stainless steel forceps with fine tip	Sigma-Aldrich	Z225304-1EA
Dressing tissue forceps	Sigma-Aldrich	F4392-1EA
Petri dishes in polystyrene	Sigma-Aldrich	P5731-500EA
Aluminium foil, thickness 0.5 mm	Sigma-Aldrich	266574-3.4G
Isopore membrane filter (0.2 µm pore size)	Millipore	GTTP Filter code
Round glass coverslip (22 mm diameter)	Neuvitro	GG-22
Round glass coverslip (25 mm diameter)	Neuvitro	GG-25
Variable volume micropipette	Sigma-Aldrich	Z114820
Protein microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	Z666505-100EA
Scalpel handles	Sigma-Aldrich	S2896-1EA
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2771-100EA
Cell culture flasks (75 cm2)	Sigma-Aldrich	CLS430641
Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel)	Sigma-Aldrich	Z613983-1EA
Polydimethylsiloxane	Dow Corning	Sylgard 184 silicone elastomer kit
Acrylamide (powder)	Sigma-Aldrich	A3553
N,N’-Methylenebis(acrylamide)	Sigma-Aldrich	146072
N-Hydroxyethylacrylamide	Sigma-Aldrich	697931
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
Amonium PerSulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate	Sigma-Aldrich	1805
Human Plasma Fibronectin	Millipore	FC010
Laminin from EHS	Sigma-Aldrich	L2020
Sodium hydroxyde	Sigma-Aldrich	221465-25G
Double-distilled water (ddH2O)
Endothelial cell growth medium	Cells Applications	211K-500
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Invitrogen	C-003-5C
Accutase	PAA laboratories	L11-007
HEPES buffer solution 1 M in H2O	Sigma-Aldrich	83264-500ML-F
Antibiotics-antimycotics	PAA laboratories	P11-002
Phosphate Buffer Saline solution	PAA laboratories	H15-002
Alexa Fluor 488 Phaloidin	Molecular Probes	A12379
Anti-vinculin antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	V9131
Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine	Molecular Probes	T-2762
Anti-Fibronectin (rabbit)	Sigma-Aldrich	F3648
Streptavidin	Sigma-Aldrich	41469
Anti-Laminin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	L9393
Anti-rabbit IgG-FITC	Sigma-Aldrich	F7512
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924-100ML
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	459844-2.5L