Preparazione di idrossi-PAAM idrogel per dissociare gli effetti di meccanotrasduzione Cues

Riepilogo

Vi presentiamo un nuovo idrogel di poliacrilamide, chiamato idrossi-PAAM, che permette un legame diretto di proteine ​​ECM con un costo minimo o esperienza. La combinazione di idrossi-PAAM Idrogel con stampa microcontact facilita il controllo indipendente di molti spunti del microambiente naturale delle cellule per studiare mechanostransduction cellulare.

Abstract

E 'ormai ben noto che molte funzioni cellulari sono regolate da interazioni delle cellule con spunti fisico-chimiche e meccaniche della loro matrice extracellulare (ECM) ambiente. Le cellule eucariotiche sentono costantemente il loro microambiente locale attraverso meccanosensori superficie di trasdurre i cambiamenti fisici di ECM in segnali biochimici, e integrare questi segnali per raggiungere specifici cambiamenti nell'espressione genica. È interessante notare che i parametri fisico-chimiche e meccaniche della coppia ECM lattina con l'altro per regolare destino cellulare. Pertanto, una chiave per comprendere meccanotrasduzione è quello di disaccoppiare il contributo relativo di spunti ECM sulle funzioni cellulari.

Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato sperimentale per generare rapidamente e facilmente idrogel biologicamente rilevanti per la messa a punto indipendente di spunti meccanotrasduzione in vitro. Noi idrogel di poliacrilamide modificati chimicamente (PAAM) per superare i loro intrinsecamente non ADHESive proprietà incorporando monomeri di acrilammide idrossile-funzionalizzati durante la polimerizzazione. Abbiamo ottenuto un romanzo PAAM idrogel, chiamato idrossi-PAAM, che consente l'immobilizzazione di qualsiasi natura desiderato di proteine ​​ECM. La combinazione di idrossi-Paam Idrogel con stampa microcontact permette di controllare indipendentemente la morfologia delle cellule singole, la rigidità della matrice, la natura e la densità delle proteine ​​ECM. Mettiamo a disposizione un metodo semplice e rapido che può essere impostato in ogni laboratorio di biologia per studiare nei processi meccanotrasduzione cellule in vitro. Abbiamo convalidare questo romanzo piattaforma bidimensionale conducendo esperimenti sulle cellule endoteliali che dimostrano un accoppiamento meccanico tra ECM rigidità e il nucleo.

Introduzione

Molti aspetti del microambiente cellulare locale (ad esempio, la rigidità, dimensione dei pori, la natura delle proteine, o di densità delle cellule-ligando) forniscono una serie coordinata di spunti normativi che controllano processi cellulari come la motilità, proliferazione cellulare, differenziamento, e l'espressione genica. Le modifiche delle proprietà fisico-chimiche dell'ambiente extracellulare possono essere percepiti dalle cellule e causare diverse conseguenze fisiologiche, tra cui la deformazione della polarizzazione cellulare, la migrazione e la differenziazione. Non è chiaro, tuttavia, come le cellule traducono ECM modifiche in segnali biochimici cellulari. E 'quindi di grande importanza per Ingegnere controllata in microambienti in vitro in grado di riprodurre le interazioni tra cellule e il loro microambiente per studiare percorsi meccanotrasduzione. Per risolvere questo problema, abbiamo recentemente introdotto un nuovo metodo ^1, chiamato idrogel-PAAM idrossi, di generare facilmente due dimematrici nsional morbidi che permettono di controllare in modo indipendente importanti spunti meccanotrasduzione: rigidezza, matrice di geometria cellulare e confinamento, la natura delle proteine ​​e densità cellulare-ligando.

ECM dirige processi cellulari attraverso gradienti in morphogens (chemiotassi), proteine ​​adesive (haptotaxis) e rigidità (durotaxis). Nel corso degli ultimi decenni, avanzata in piattaforme vitro sono stati sviluppati per isolare questi segnali extracellulari, al fine di prendere in giro fuori come le cellule sono in grado di tradurre le caratteristiche biochimiche e biofisiche in processi fisiologici ^2-5. Sono stati sviluppati a fascio elettronico ^6, fotolitografia ^{7, 8} immobilizzazione fotochimico o tecniche plasma assistita ⁹ per dirigere la crescita delle cellule viventi su substrati micropatterned. Anche se queste tecniche hanno dato risultati importanti, la maggior parte di essi non consentono una discriminazione tra l'influenza individuale di diversi spunti sul comportamento delle cellulee richiedono attrezzature tecniche che pochi laboratori possono permettersi. Tra queste tecniche, stampa microcontact (μCP), è emerso come un metodo affidabile e accessibile per creare cellule-adesivo micro-isole ^10. Più di recente, grandi sforzi ^11-14 sono stati fatti per sviluppare μCP su idrogel con rigidità accordabili in modo da riprodurre la vasta gamma di rigidità osservati nei tessuti viventi. Tra queste opere, poliacrilammide (PAAM) è diventata popolare ¹⁵ ed è già una delle matrici a base di polimeri più comunemente usati per la biomeccanica cellulari saggi.

Superfici Paam sono comunemente funzionalizzati con il eterobifunzionale reticolante N-sulfosuccinimidyl-6-proteine ​​[4'-azido-2'-nitrophenylamido] (solfo-SANPAH) e ECM sono legati alla superficie mediante attivazione UV del nitrofenil solfo-SANPAH gruppi azide ^16. Un'altra tecnica consiste nel idrazina accoppiamento a proteine ​​che sono stati gravemente ossidaticon periodato ^17. Hynd e collaboratori hanno introdotto una tecnica per patterning di superfici idrogel biomimetici con proteine ​​e peptidi che richiede fotopolimerizzazione in presenza di un monomero acroyl-streptavidina ^18. Più recentemente, Tseng et al. Hanno segnalato un nuovo metodo micropatterning ¹⁹ sulla base dell'esposizione ai raggi UV profondo di PAAM attraverso una maschera di quarzo ottico che richiede di incubare gel PA attivati ​​con 1-etil-3-[3-dimetilamminopropil] carbodiimide cloridrato (EDC) e N-idrossisuccinimmide (NHS) soluzioni di acqua prima di aggiungere la proteina. Nonostante la capacità di queste tecniche per creare omogenei e riproducibili proteine ​​microdisegni, la maggior parte di loro soffrono maggiori limitazioni: processi lunghi di sintesi (ad esempio, dialisi, liofilizzazione, ecc), composti chimici costosi (ad esempio, l'acido ialuronico, solfo-SANPAH) o UV profondo irradiazione. Inoltre, queste tecniche non consentono la modulazione indipendente substrato rigidità, micropatterngeometria, ECM natura proteica, e la densità delle cellule-ligando.

Prendendo queste limitazioni in considerazione, abbiamo sviluppato un nuovo approccio e semplice a base di acrilammide, che consente l'immobilizzazione di una varietà di proteine ​​e biomolecole su idrogel morbido e permette la sintonizzazione indipendente di spunti meccanotrasduzione al fine di decifrare il loro ruolo sulle funzioni cellulari. Invece di trattare idrogel PAAM con composti chimici aggressivi, introduciamo un monomero acrilammide commerciale con gruppi idrossilici PAAM durante la polimerizzazione. Questa semplice operazione supera la proprietà anti-adesive intrinseca degli idrogel PAAM senza altri requisiti tecnici.

La presenza di gruppi ossidrilici porta ad una elevata affinità di idrogel-idrossi Paam per proteine ​​e biomolecole che formano interazioni di idrogeno-bonding. In combinazione con μCP, idrogel-PAAM idrossi consentono una rapida generazione di piattaforma cultura bidimensionale con un controllo indipendentesulla rigidità matrice, tipo di proteine ​​ECM, densità cellulare-ligando e adesività limitata, che si immaginava di essere una potente piattaforma per lo studio meccanotrasduzione.

Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire le informazioni necessarie per rendere facilmente idrogel-PAAM idrossi senza alcuna competenza in scienze dei materiali. L'obiettivo finale è quello di fornire un mezzo per i ricercatori di porre domande fisiologicamente rilevanti a livello cellulare e dei tessuti che possono portare ad una migliore comprensione delle vie meccanotrasduzione coinvolti nei meccanismi fisiopatologici.

Protocollo

1 Attivazione della superficie di coprioggetto di vetro

1. Luogo coprioggetto di vetro circolare (diametro 25 mm) in una capsula di Petri e striscio 0,1 M di NaOH soluzione su di esso per 5 min (cappa consigliata).
2. Rimuovere la soluzione di NaOH e immergere completamente coprioggetto con DDH ₂ O sterile per 20 minuti mentre delicatamente dondolo su un piatto oscillante in una cappa sterile cultura.
3. Scolare sterile DDH ₂ O e ripetere il passaggio 1.2.
4. Togliere i coprioggetti con una pinzetta sterile e metterli in un nuovo piatto di Petri con la faccia attivata alto.
5. Coprioggetti secco sotto un flusso costante di gas azoto ad alta purezza.
6. In una cappa sterile cultura, spalmare uno strato sottile di 3-acrilato (trimetossisilil) propil (92%) sul lato attivo del vetrino per 1 ora.
7. Ampiamente lavare vetrini con 3 lavaggi di DDH ₂ O sterile e immergerli in DDH ₂ O sterile in un nuovo piatto di Petri.
8. Toccare la piastra di Petricon Parafilm e metterlo su un piatto rocker sotto agitazione per 10 min.
9. Togliere i coprioggetti dai DDH ₂ O con una pinzetta sterile con punte sottili e metterli in un nuovo piatto di Petri con la faccia attivata alto.
10. Conservare a temperatura ambiente in un luogo asciutto con un foglio di alluminio per evitare che la polvere di attaccarsi i coprioggetti.

2 Preparazione di idrossi-PAAM idrogel

1. Preparare un peso di 65 mg di N-idrossietil acrilammide (HEA) in una provetta Eppendorf da 1,5 ml. È importante preparare una soluzione HEA fresca.
2. Aggiungere 1 ml di tampone HEPES 50 mM a HEA e mescolare utilizzando un vortex fino a quando la dissoluzione HEA completo.
3. Aggiungere 400 ml di 40% w / w in HEPES soluzione di acrilammide e il volume del 2% richiesto w / w in HEPES soluzione di bis-acrilammide (vedi Tabella 1) per raggiungere la rigidità idrogel desiderata. Regolare con HEPES 50 mM ad un volume finale di 5 ml.
4. Mescolare la soluzione con un vortex e Degas itin una camera a vuoto per 20 minuti al fine di ridurre la concentrazione di ossigeno all'interno della soluzione, che impedisce idrossi-Paam polimerizzazione.
5. Sotto una cappa sterile, filtrare la soluzione degased con un filtro di dimensione dei pori di 0,2 micron per sterilizzarlo.
6. Attivare vetrini circolari (diametro 22 mm) in un pulitore UV / ozono durante 7 min.
7. Preparare 100 ml di soluzione al 10% di ammonio persolfato (APS), che è di 10 APS mg su 100 ml DDH ₂ O. È importante preparare una soluzione APS fresca.
8. Aggiungere 2,5 ml di tetramethylenediamine (TEMED) e 25 ml di soluzione di APS al idrossi-PAAM soluzione sterilizzata (punto 2.5) per avviare la polimerizzazione. Miscelare la soluzione da 3 pipettaggi successive senza introduzione di bolle, in condizioni di sterilità.
9. Sotto una cappa sterile, una goccia 25 ml della soluzione di idrossi-PAAM su un coprioggetto 25 mm (disponibile dal punto 1.9) e subito mettere un gl 22 millimetriass coprioggetto (preparato nel passaggio 2.5) sulla parte superiore della goccia per spremere la soluzione idrossi-PAAM. Centrare il coprioggetto di vetro 22 millimetri con una pinzetta sterile e appianare eventuali bolle.
10. Consenti idrogel-idrossi PAAM a polimerizzare a temperatura ambiente per 15 min. Invertire manualmente la restante soluzione idrossi-Paam nel tubo Eppendorf a seguire il completamento del processo di polimerizzazione.
11. Immergere completamente coprioggetto con sterile DDH ₂ O e separare con attenzione le 22 coprioggetto mm di vetro, introducendo il bordo di una lama di rasoio tra i 22 coprioggetto mm di vetro e lo strato di idrogel idrossi-PAAM.
12. Lavare idrogel-idrossi PAAM con PBS sterile (3 scambi di PBS), e lasciare che i gel completamente immersi in PBS sterile per mantenere l'idratazione.
13. Conservare idrogel-idrossi PAAM in PBS sterile a 4 ° C per un massimo di 3 giorni.

3. polidimetilsilossano (PDMS) Microstamp Fabrication

NOTA: La realizzazione di un maestro di silicio è necessario prima di staRT Il PDMS fabbricazione microstamp. Questo microfabbricazione di un maestro di silicio può essere fatto con tecniche litografiche, che richiede attrezzature e formazione specializzata. Collaborazioni con un impianto di nanofabbricazione sono incoraggiati a realizzare il master di silicio. In alternativa, contattare una società che fabbrica i padroni di silicio microstrutturato personalizzati su richiesta. È importante notare che la realizzazione del master silicio deve solo essere fatto una volta. Infatti, maestri di silicio microstrutturate possono essere utilizzati a tempo indefinito per produrre francobolli elastomerici.

1. Mix PDMS e il catalizzatore in un rapporto di 10: 1 in un bicchiere di plastica e mescolare accuratamente con una pipetta per 10 min.
2. Degassare la miscela PDMS sotto vuoto per rimuovere le bolle d'aria che si sono formate durante la fase 3.1.
3. Posizionare il maestro silicio microstrutturata in una capsula di Petri e gettato uno strato di spessore di 10 mm di miscela degasato PDMS su di essa senza formare bolle.
4. Lasciate curare le PDMS per 2 ore a 60 ° C in unforno.
5. In un ambiente privo di polvere, peel-off lo strato PDMS e accise 1 cm ² microstamps con un bisturi.
6. Utilizzando pinze, posto PDMS microstamps modello-up in una capsula di Petri.

4. micropatterning idrossi-PAAM idrogel

1. Luogo PDMS microstamps in un etanolo / acqua e la soluzione sonicare (50/50) per 15 min.
2. Asciugare i francobolli con un flusso di flusso di azoto e di metterli modello-up in un pulitore UV / ozono (λ <200 nm) per 7 min.
3. Sotto una cappa sterile, mettere una goccia di 150 ml di una soluzione di proteina desiderata (ad esempio, 100 mg / ml in PBS laminina o 25 mg / ml di fibronectina in PBS) sulla superficie microstrutturata di un 1 cm ² PDMS bollo.
4. Opzionale: Modificare la concentrazione della soluzione proteica di modulare la densità cellulare-ligando.
5. Stendere la soluzione proteica sulla superficie timbro muovendo con una punta sterile di una pipetta verso l'angolo diil timbro.
6. Lasciare la soluzione proteica per assorbire il timbro PDMS per 60 minuti sotto una cappa sterile. Spegnere le lampade per evitare danni proteine.
7. Sotto una cappa sterile, trasferire vetrini rivestiti idrossi-PAAM (disponibili dal punto 2.13) in una capsula di Petri.
8. Rimuovere l'eccesso di PBS dalla superficie dei substrati idrossi-Paam con una bassa corrente di azoto in condizioni sterili. Interrompere la procedura appena alcuna prova di acqua in piedi sulla superficie del gel si osserva. Il gel non deve essere asciugata bene in questa fase.
9. Asciugare accuratamente la superficie strutturata di PDMS bollo con un flusso costante di gas azoto ad alta purezza.
10. Afferrare il timbro proteina rivestite con una pinza tessuto medicazione e posizionare la superficie strutturata in contatto con la superficie idrogel essiccato. Applicare punti di pressione brevi con la punta delle pinzette sulla parte superiore del timbro PDMS per assicurare un buon contatto tra microfeatures bollo e la superficie idrogel.
11. Lasciare il timbro PDMS su the superficie idrogel per 1 ora a temperatura ambiente.
12. Rimuovere delicatamente PDMS francobolli da idrogel idrossi-PAAM con una pinza di tessuto medicazione e seguire il passo 4.1 per pulire il timbro.
13. Lavare ampiamente idrogel-PAAM idrossi timbrato da 3 scambi di PBS (pH = 7,4) in condizioni di sterilità per 10 minuti per ogni cambio.
14. Optional: Ulteriori microdisegni di altre proteine ​​ECM possono essere aggiunti al-PAAM idrossi superficie seguendo i passaggi 4,5-4,11.
15. Zone non stampate passivare con una soluzione sterile di BSA a 5 mg / ml in PBS durante una notte a 4 ° C sotto agitazione delicata su una piastra oscillante.
16. Lavare estesamente da 3 scambi di PBS (pH = 7,4) in condizioni di sterilità per 10 minuti per ogni cambio. In questa fase, stampati idrogel-PAAM idrossi possono essere conservati a 4 ° C fino ad una settimana.

5. Deposizione cellulare su micropatterned idrossi-PAAM idrogel

1. Incubare coprioggetto in mezzi cella per 30-45 minuti prima di placcatura cells.
2. Lavare le cellule aderenti coltivate in un pallone di 75 centimetri ² coltura con PBS sterile a 37 ° C e staccarlo con 3 ml di tripsina-EDTA o accutase per 10 min.
3. Trasferire la quantità desiderata di pre-riscaldato completo terreno di coltura appropriato per la linea cellulare nel pallone contenente le cellule staccate e centrifugare la sospensione cellulare per 3 min a 650 x g.
4. Rimuovere il surnatante con una micropipetta e risospendere le cellule in terreno di coltura completo a 15-20.000 cellule / ml.
5. Aggiungere 4 ml della soluzione di cellule di un coprioggetto micropatterned (ottenuto dal punto 5.1) e posizionare la cella coprioggetto coperto in un incubatore a 37 ° C e 5% di umidità per 1-2 ore.
6. Aspirare delicatamente le cellule senza legami e sostituire il terreno di coltura. Riportare le cellule attaccate alla incubatore e farli diffondono completamente (3-6 ore, a seconda del tipo di cellula).

Risultati

Figura 1A presenta la co-polimerizzazione di acrilammide (AAm) e bisacrylamide (bis-AAm) con N-hydroxyethylacrylamide (HEA) monomeri contenenti un ossidrile primario formata da casuale polimerizzazione radicalica una rete idrofila di poliacrilammide con gruppi idrossilici incorporati (idrossi-Paam) . In questo protocollo, un peso di 65 mg di HEA deve essere diluita in un volume di 1 ml di HEPES. Sapendo che la densità di HEA è approssimativamente uguale a uno, assumiamo che si ottiene un volume di lav...

Discussione

Molte osservazioni in vitro nella moderna biologia cellulare sono state eseguite su vetrini rigidi, spesso rivestiti con un sottile strato di proteine ​​ECM o peptidi sintetici contenenti la sequenza RGD. Tuttavia, tali substrati di coltura di base non ricapitolano l'intera complessità fisico-chimiche della ECM e quindi non forniscono un modello accurato per lo studio dei processi meccanotrasduzione cellulari. Per affrontare questo problema, vi proponiamo una semplice alternativa a funzionalizzare idro...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
UV/Ozone Photoreactor	Ultra-Violet Products	Model PR-100
Rocking plate	IKAcWerke	Model KS 130 Basic
Vortexer	Scientific Industries	Model Vortex Genie2
Vacuum degassing chamber	Applied Vacuum Engineering	DP- 8-KIT
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
Stainless steel forceps with fine tip	Sigma-Aldrich	Z225304-1EA
Dressing tissue forceps	Sigma-Aldrich	F4392-1EA
Petri dishes in polystyrene	Sigma-Aldrich	P5731-500EA
Aluminium foil, thickness 0.5 mm	Sigma-Aldrich	266574-3.4G
Isopore membrane filter (0.2 µm pore size)	Millipore	GTTP Filter code
Round glass coverslip (22 mm diameter)	Neuvitro	GG-22
Round glass coverslip (25 mm diameter)	Neuvitro	GG-25
Variable volume micropipette	Sigma-Aldrich	Z114820
Protein microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	Z666505-100EA
Scalpel handles	Sigma-Aldrich	S2896-1EA
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2771-100EA
Cell culture flasks (75 cm2)	Sigma-Aldrich	CLS430641
Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel)	Sigma-Aldrich	Z613983-1EA
Polydimethylsiloxane	Dow Corning	Sylgard 184 silicone elastomer kit
Acrylamide (powder)	Sigma-Aldrich	A3553
N,N’-Methylenebis(acrylamide)	Sigma-Aldrich	146072
N-Hydroxyethylacrylamide	Sigma-Aldrich	697931
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
Amonium PerSulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate	Sigma-Aldrich	1805
Human Plasma Fibronectin	Millipore	FC010
Laminin from EHS	Sigma-Aldrich	L2020
Sodium hydroxyde	Sigma-Aldrich	221465-25G
Double-distilled water (ddH2O)
Endothelial cell growth medium	Cells Applications	211K-500
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Invitrogen	C-003-5C
Accutase	PAA laboratories	L11-007
HEPES buffer solution 1 M in H2O	Sigma-Aldrich	83264-500ML-F
Antibiotics-antimycotics	PAA laboratories	P11-002
Phosphate Buffer Saline solution	PAA laboratories	H15-002
Alexa Fluor 488 Phaloidin	Molecular Probes	A12379
Anti-vinculin antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	V9131
Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine	Molecular Probes	T-2762
Anti-Fibronectin (rabbit)	Sigma-Aldrich	F3648
Streptavidin	Sigma-Aldrich	41469
Anti-Laminin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	L9393
Anti-rabbit IgG-FITC	Sigma-Aldrich	F7512
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924-100ML
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	459844-2.5L