Preparación de hidroxi-Paam hidrogeles para desacoplar los efectos de mecanotransducción Cues

Resumen

Presentamos un nuevo hidrogel de poliacrilamida, llamado hidroxi-Paam, que permite una unión directa de las proteínas ECM con costo o experiencia mínima. La combinación de hidroxi-Paam hidrogeles con impresión por microcontacto facilita el control independiente de muchas señales del microambiente celular natural para el estudio de mechanostransduction celular.

Resumen

Ahora está bien establecido que muchas funciones celulares están reguladas por interacciones de las células con señales fisicoquímicas y mecánicas de su matriz extracelular (ECM) medio ambiente. Las células eucariotas constantemente perciben su microambiente local a través mechanosensors superficie para transducir cambios físicos de la ECM en señales bioquímicas, e integrar estas señales para lograr cambios específicos en la expresión génica. Curiosamente, los parámetros físico-químicas y mecánicas de la pareja ECM puede uno con el otro para regular el destino celular. Por lo tanto, la clave para entender mecanotransducción es disociar la contribución relativa de las señales de ECM en las funciones celulares.

Aquí se presenta un protocolo experimental detallado para generar rápida y fácilmente hidrogeles biológicamente relevantes para la puesta a punto independiente de señales mechanotransduction in vitro. Nosotros, los hidrogeles de poliacrilamida modificados químicamente (PAAM) para superar sus intrínsecamente no ADHESive propiedades mediante la incorporación de monómeros de acrilamida hidroxilo funcionalizado durante la polimerización. Obtuvimos una novela Paam hidrogel, llamado hidroxi-Paam, que permite la inmovilización de cualquier naturaleza deseada de las proteínas ECM. La combinación de hidroxi-Paam hidrogeles con impresión por microcontacto permite controlar independientemente la morfología de las células individuales, la rigidez de la matriz, la naturaleza y la densidad de las proteínas ECM. Proporcionamos un método simple y rápido que se puede establecer en cada laboratorio de biología para estudiar en los procesos mechanotransduction celular in vitro. Estamos validar esta nueva plataforma de dos dimensiones mediante la realización de experimentos en células endoteliales que demuestran un acoplamiento mecánico entre la rigidez del ECM y el núcleo.

Introducción

Muchos aspectos de la microambiente celular local (por ejemplo, rigidez, tamaño de poro, la naturaleza de las proteínas, o la densidad de células ligando) proporcionan un conjunto de coordenadas de las señales reguladoras que controlan los procesos celulares, tales como la motilidad, la proliferación celular, la diferenciación y la expresión génica. Las modificaciones de las propiedades fisicoquímicas del medio ambiente extracelular pueden ser percibidos por las células y causan diferentes consecuencias fisiológicas, incluyendo la deformación de la polarización celular, la migración, y diferenciación. No queda claro, sin embargo, cómo las células se traducen modificaciones ECM en señales bioquímicas celulares. Por lo tanto, de gran importancia para diseñar controlada en microambientes in vitro que pueden reproducir las interacciones entre las células y su microambiente para el estudio de las vías de mechanotransduction es. Para abordar este problema, hemos introducido recientemente un nuevo método ^1, llamado hidrogeles-Paam hidroxi, para generar fácilmente de dos moneda de diez centavosmatrices nsional suaves que permiten controlar de forma independiente importantes señales mechanotransduction: matriz de rigidez, geometría celular y de confinamiento, la naturaleza de la proteína y la densidad de células ligando.

ECM dirige los procesos celulares a través de gradientes en morfógenos (quimiotaxis), proteínas adhesivas (Haptotaxis) y rigidez (durotaxis). En los últimos decenios, avanzada en plataformas in vitro han sido desarrollados para aislar estas señales extracelulares con el fin de desentrañar cómo las células son capaces de traducir las características bioquímicas y biofísicas en los procesos fisiológicos ^2-5. Se han desarrollado por haz de electrones ^{6, 7} fotolitografía, la inmovilización fotoquímica ^8, o técnicas de plasma asistida ⁹ para dirigir el crecimiento de las células vivas sobre sustratos micropatterned. Aunque estas técnicas han dado resultados importantes, la mayoría de ellos no permiten la discriminación entre la influencia individual de diferentes señales en el comportamiento celulary requieren instalaciones técnicas que pocos laboratorios pueden permitirse. Entre estas técnicas, la impresión por microcontacto (μCP), ha surgido como un método robusto y accesible para crear micro-islas de células adhesivo ^10. Más recientemente, grandes esfuerzos ^11-14 se han hecho para desarrollar μCP en hidrogeles con rigideces sintonizables con el fin de reproducir la amplia gama de rigideces observadas en los tejidos vivos. Entre estas obras, la poliacrilamida (PAAM) se ha hecho popular ^{el 15} y ya es una de las matrices a base de polímeros más utilizados para los ensayos de biomecánica celulares.

Superficies Paam son comúnmente funcionalizado con el agente de reticulación heterobifuncional sulfosuccinimidil proteínas-N-6-[4 '-azido-2'-nitrophenylamido] (sulfo-SANPAH) y ECM están unidos a la superficie por la activación de UV de la sulfo-nitrofenil SANPAH grupos azida ^16. Otra técnica consiste en hidrazina de acoplamiento a las proteínas que han sido severamente oxidadascon peryodato ^17. Hynd y colaboradores introdujeron una técnica para modelando superficies de hidrogel biomiméticos con proteínas y péptidos que requiere fotopolimerización en presencia de un monómero de acriloílo estreptavidina ^18. Más recientemente, Tseng et al. Han informado de un nuevo método micropatterning ¹⁹ basado en la exposición UV profunda de PAAM a través de una máscara de cuarzo óptico que requiere incubar PA geles activados con 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) soluciones de agua antes de añadir la proteína. A pesar de la capacidad de estas técnicas para crear homogéneos y reproducibles micropatrones proteínas, la mayoría de ellos sufren limitaciones importantes: los procesos de síntesis larga (por ejemplo, diálisis, liofilización, etc), compuestos químicos caros (por ejemplo, ácido hialurónico, sulfo-SANPAH) de profundidad o UV irradiación. Además, estas técnicas no permiten la modulación independiente de la rigidez del sustrato, micropatróngeometría, ECM proteína naturaleza, y la densidad de células ligando.

Teniendo en cuenta estas limitaciones, hemos desarrollado un enfoque basado en acrilamida novedoso y simple que permite la inmovilización de una variedad de proteínas y biomoléculas en hidrogeles blandos y permite la sintonización independiente de señales mechanotransduction el fin de descifrar su papel en las funciones celulares. En lugar de tratar hidrogeles Paam con compuestos químicos agresivos, se introduce un monómero de acrilamida comercial con grupos hidroxilo durante la polimerización Paam. Esta sencilla operación supera la propiedad anti-adhesivo intrínseca de hidrogeles Paam sin otros requisitos técnicos.

La presencia de grupos hidroxilo conduce a una alta afinidad de los hidrogeles-hidroxi Paam para las proteínas y biomoléculas que forman interacciones de enlaces de hidrógeno. En combinación con μCP, hidrogeles-hidroxi Paam permiten una rápida generación de plataforma de la cultura de dos dimensiones con un control independienteen la rigidez de la matriz, el tipo de proteínas ECM, la densidad de células ligando y adhesividad confinado, que se imaginó ser una plataforma poderosa para el estudio mecanotransducción.

El objetivo de este protocolo es proporcionar la información necesaria para hacer fácilmente hidrogeles Paam hidroxi sin ninguna experiencia en la ciencia de materiales. El objetivo final es proporcionar un medio para que los investigadores hacen preguntas fisiológicamente relevantes a nivel celular y de tejidos que pueden conducir a una mejor comprensión de las vías mechanotransduction involucradas en mecanismos fisiopatológicos.

Protocolo

1. activar la superficie del cubreobjetos de vidrio

1. Lugar cubreobjetos de vidrio circulares (25 mm de diámetro) en una placa de Petri y frotis solución 0,1 M de NaOH en él durante 5 min (campana química recomendada).
2. Eliminar la solución de NaOH y sumergirse plenamente cubreobjetos con ddH ₂ O estéril durante 20 minutos mientras se balancea suavemente sobre una placa oscilante en una campana de cultivo estéril.
3. Escurrir estéril _ddH2O y repita el paso 1.2.
4. Quitar los cubreobjetos con unas pinzas estériles y colocarlos en una nueva placa de Petri con la cara activado para arriba.
5. Cubreobjetos seco bajo un flujo constante de gas nitrógeno de alta pureza.
6. En una campana de cultivo estéril, frotis de una capa fina de acrilato de 3 (trimetoxisilil) propil (92%) en el lado activada del cubreobjetos durante 1 h.
7. Lavar extensivamente cubreobjetos de vidrio con 3 lavados de ddH ₂ O estéril y sumergirlos en ddH ₂ O estéril en una nueva placa de Petri.
8. Toque en la placa de Petricon Parafilm y colocarlo en una placa del balancín con agitación suave durante 10 minutos.
9. Quitar los cubreobjetos de _ddH2O con pinzas estériles con puntas finas y colocarlas en una nueva placa de Petri con la cara activado para arriba.
10. Almacenar a temperatura ambiente en un lugar seco con papel de aluminio para evitar que el polvo se pegue a los cubreobjetos.

2 Preparación de hidrogeles hidroxi-Paam

1. Preparar un peso de 65 mg de acrilamida N-hidroxietilo (HEA) en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Es importante para preparar una solución HEA fresco.
2. Añadir 1 ml de 50 mM de tampón HEPES a HEA y mezclar usando un agitador de vórtice hasta la disolución completa de la HEA.
3. Añadir 400 l de 40% w / w en HEPES solución de acrilamida y el volumen requerido de 2% w / w en HEPES solución de bis-acrilamida (véase la Tabla 1) para llegar a la rigidez de hidrogel deseada. Ajuste con HEPES 50 mM a un volumen final de 5 ml.
4. Mezclar la solución con un vórtice y desgasificar iten una cámara de vacío durante 20 min con el fin de reducir la concentración de oxígeno dentro de la solución, lo que impide la polimerización hidroxi-PAAM.
5. Bajo una campana estéril, filtrar la solución desgasificada con un filtro de tamaño de poro 0,2 micras con el fin de esterilizarlo.
6. Activar cubreobjetos de vidrio circulares (22 mm de diámetro) en un limpiador UV / ozono durante 7 min.
7. Preparar 100 l de solución de persulfato de amonio al 10% (APS), es decir 10 mg de APS en 100 l ddH ₂ O. Es importante preparar una solución de APS fresco.
8. Añadir 2,5 l de tetrametilendiamina (TEMED) y 25 l de solución de APS a la solución esterilizada hidroxi-Paam (paso 2.5) para iniciar la polimerización. Mezclar la solución por 3 pipeteados sucesivos sin la introducción de burbujas, en condiciones estériles.
9. Bajo una campana estéril, coloque una gota de 25 l de la solución de hidroxi-Paam sobre un cubreobjetos de 25 mm (disponible desde el paso 1.9) e inmediatamente colocar un gl 22 mmcubreobjetos culo (preparado en el paso 2.5) en la parte superior de la gotita para exprimir la solución hidroxi-PAAM. Centre el cubreobjetos de vidrio de 22 mm con pinzas estériles y suavizar las burbujas.
10. Permitir hidrogeles-hidroxi Paam para polimerizar a temperatura ambiente durante 15 min. Invertir manualmente la solución hidroxi-Paam restante en el tubo de Eppendorf a seguir la finalización del proceso de polimerización.
11. Sumerja totalmente con cubreobjetos estéril ddH ₂ O y separar cuidadosamente los cubreobjetos de 22 mm de vidrio mediante la introducción del borde de una hoja de afeitar entre los 22 mm cubreobjetos de vidrio y la capa de hidrogel hidroxi-PAAM.
12. Lave hidrogeles Paam hidroxi con PBS estéril (3 intercambios de PBS) y dejar que los geles totalmente inmersos en PBS estéril para mantener la hidratación.
13. Guarde hidrogeles Paam hidroxi en PBS estéril a 4 ° C hasta por 3 días.

3. polidimetilsiloxano (PDMS) Microstamp Fabrication

NOTA: La fabricación de un maestro de silicio se requiere antes de stata los PDMS fabricación microstamp. Esta microfabricación de un maestro de silicio se puede hacer mediante técnicas litográficas, lo que requiere equipo especializado y la formación. Se anima Colaboraciones con una instalación de nanofabricación para fabricar el maestro de silicio. Como alternativa, póngase en contacto con una empresa que fabrica maestros silicio microestructurada a medida bajo demanda. Es importante señalar que la fabricación del maestro de silicio sólo necesita hacerse una vez. De hecho, los maestros de silicio microestructuradas pueden utilizarse indefinidamente para producir sellos elastoméricos.

1. Mezcla de PDMS y el agente de curado en una proporción de 10: 1 en un vaso de precipitados de plástico y mezclar bien con una pipeta durante 10 min.
2. Desgasificar la mezcla de PDMS al vacío para eliminar las burbujas de aire que se formaron durante la etapa 3.1.
3. Coloque el maestro de silicio microestructurada en una placa de Petri y emitir una capa gruesa de 10 mm de mezcla desgasificada PDMS en él sin que se formen burbujas.
4. Dejar curar el PDMS durante 2 horas a 60 ° C en unhorno.
5. En un entorno libre de polvo, de despegar de la capa de PDMS y los impuestos especiales 1 cm ² microstamps con un bisturí.
6. El uso de pinzas, lugar PDMS microstamps patrón-en una placa de Petri.

4. micropatterning hidroxi-Paam hidrogeles

1. Coloque PDMS microstamps en una mezcla de etanol / agua (50/50) solución y se somete a ultrasonidos durante 15 min.
2. Secar los sellos con una corriente de flujo de nitrógeno y colocarlos patrón-en un limpiador UV / Ozono (λ <200 nm) durante 7 min.
3. Bajo una campana estéril, colocar una gota de 150 l de una solución de proteína deseada (por ejemplo, 100 mg / ml de laminina en PBS o 25 mg / ml de fibronectina en PBS) sobre la superficie microestructurada de un 1 ^cm-2 PDMS sello.
4. Opcional: Modificar la concentración de la solución de proteína para modular la densidad de células ligando.
5. Corre la solución de proteína a través de la superficie del sello moviéndolo con una punta estéril de una pipeta de una hacia la esquina deel sello.
6. Deje la solución de proteína para adsorber en el sello PDMS durante 60 minutos bajo una campana estéril. Apague las lámparas para evitar daño a las proteínas.
7. Bajo una campana estéril, transferir hidroxi-Paam cubreobjetos recubiertos (disponibles desde el paso 2,13) ​​en una placa de Petri.
8. Eliminar el exceso de PBS de la superficie de sustratos hidroxi-Paam con una corriente de nitrógeno bajo en condiciones estériles. Detener el procedimiento tan pronto como se observó ninguna evidencia de agua estancada en la superficie del gel. El gel no debe ser secado a fondo en esta etapa.
9. Seca cuidadosamente la superficie estructurada de los PDMS sello con un flujo constante de gas nitrógeno de alta pureza.
10. Sujete el sello recubierto de proteína con pinzas de tejidos vestidores y coloque la superficie estructurada en contacto con la superficie del hidrogel seco. Aplicar puntos de presión breves con la punta de las pinzas en la parte superior del sello PDMS para asegurar un buen contacto entre microfeatures sello y de la superficie del hidrogel.
11. Deje el sello PDMS en el thsuperficie del hidrogel e durante 1 hora a RT.
12. Retire con cuidado PDMS sellos de hidrogeles hidroxi-Paam con pinzas de tejidos vestidores y seguir el paso 4.1 para limpiar el sello.
13. Lavar ampliamente los hidrogeles-hidroxi Paam sellados por 3 intercambios de PBS (pH = 7,4) en condiciones estériles durante 10 min por intercambio.
14. Opcionales: micropatrones adicionales de otras proteínas ECM se pueden añadir a la superficie hidroxi-Paam siguiendo los pasos 4.5 a 4.11.
15. Zonas no impresas pasivar con una solución estéril de BSA a 5 mg / ml en PBS durante una noche a 4 ° C bajo una agitación suave en un plato oscilante.
16. Lavar ampliamente por 3 intercambios de PBS (pH = 7,4) en condiciones estériles durante 10 min por intercambio. En esta etapa, los hidrogeles-hidroxi Paam estampadas se pueden almacenar a 4 ° C durante hasta una semana.

5. deposición de células en micropatterned hidroxi-Paam hidrogeles

1. Incubar cubreobjetos en medio celular durante 30-45 minutos antes de chapado cells.
2. Lavar las células adherentes cultivadas en un 75 cm ² frasco de cultivo con PBS estéril a 37 ° C y separarlo con 3 ml de tripsina-EDTA o accutase de 10 min.
3. Transferir la cantidad deseada de pre-calentado completa medio de crecimiento apropiado para su línea de células en el matraz que contiene las células desprendidas y centrifugar la suspensión celular durante 3 minutos a 650 x g.
4. Eliminar el sobrenadante con una micropipeta y resuspender las células en medio de cultivo completo en 15-20.000 células / ml.
5. Añadir 4 ml de la solución de células a un cubreobjetos microestructurada (obtenido del Paso 5.1) y colocar el cubreobjetos de células-cubierto en un incubador de cultivo a 37 ° C y 5% de humedad durante 1-2 horas.
6. Aspirar suavemente las células no unidas y reemplazar el medio de cultivo. Devolver las células unidas a la incubadora y dejar que se extienden completamente (3-6 horas, dependiendo del tipo de célula).

Resultados

La Figura 1A presenta la co-polimerización de acrilamida (AAM) y bisacrilamida (bis-AAM) con N-hydroxyethylacrylamide (HEA) monómeros que contienen un hidroxilo primario formado por polimerización radicalar al azar una red hidrofílica de poliacrilamida con grupos hidroxilo incorporados (hidroxi-PAAM) . En este protocolo, un peso 65 mg de HEA se debe diluir en un volumen de 1 ml de HEPES. Sabiendo que la densidad de la HEA es aproximadamente igual a uno, se supone que se obtiene un volumen de trabajo...

Discusión

Muchos en observaciones in vitro de la biología celular moderna se han realizado en cubreobjetos de vidrio rígidas, a menudo recubiertos con una fina capa de proteínas ECM o péptidos sintéticos que contienen la secuencia RGD. Sin embargo, dichos sustratos de cultivo básicas no recapitulan toda la complejidad fisicoquímica del ECM y por lo tanto no proporcionan un modelo preciso para estudiar procesos celulares mechanotransduction. Para hacer frente a este problema, proponemos una alternativa sim...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
UV/Ozone Photoreactor	Ultra-Violet Products	Model PR-100
Rocking plate	IKAcWerke	Model KS 130 Basic
Vortexer	Scientific Industries	Model Vortex Genie2
Vacuum degassing chamber	Applied Vacuum Engineering	DP- 8-KIT
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
Stainless steel forceps with fine tip	Sigma-Aldrich	Z225304-1EA
Dressing tissue forceps	Sigma-Aldrich	F4392-1EA
Petri dishes in polystyrene	Sigma-Aldrich	P5731-500EA
Aluminium foil, thickness 0.5 mm	Sigma-Aldrich	266574-3.4G
Isopore membrane filter (0.2 µm pore size)	Millipore	GTTP Filter code
Round glass coverslip (22 mm diameter)	Neuvitro	GG-22
Round glass coverslip (25 mm diameter)	Neuvitro	GG-25
Variable volume micropipette	Sigma-Aldrich	Z114820
Protein microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	Z666505-100EA
Scalpel handles	Sigma-Aldrich	S2896-1EA
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2771-100EA
Cell culture flasks (75 cm2)	Sigma-Aldrich	CLS430641
Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel)	Sigma-Aldrich	Z613983-1EA
Polydimethylsiloxane	Dow Corning	Sylgard 184 silicone elastomer kit
Acrylamide (powder)	Sigma-Aldrich	A3553
N,N’-Methylenebis(acrylamide)	Sigma-Aldrich	146072
N-Hydroxyethylacrylamide	Sigma-Aldrich	697931
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
Amonium PerSulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate	Sigma-Aldrich	1805
Human Plasma Fibronectin	Millipore	FC010
Laminin from EHS	Sigma-Aldrich	L2020
Sodium hydroxyde	Sigma-Aldrich	221465-25G
Double-distilled water (ddH2O)
Endothelial cell growth medium	Cells Applications	211K-500
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Invitrogen	C-003-5C
Accutase	PAA laboratories	L11-007
HEPES buffer solution 1 M in H2O	Sigma-Aldrich	83264-500ML-F
Antibiotics-antimycotics	PAA laboratories	P11-002
Phosphate Buffer Saline solution	PAA laboratories	H15-002
Alexa Fluor 488 Phaloidin	Molecular Probes	A12379
Anti-vinculin antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	V9131
Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine	Molecular Probes	T-2762
Anti-Fibronectin (rabbit)	Sigma-Aldrich	F3648
Streptavidin	Sigma-Aldrich	41469
Anti-Laminin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	L9393
Anti-rabbit IgG-FITC	Sigma-Aldrich	F7512
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924-100ML
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	459844-2.5L