メカノキューの影響をデカップリングするためのヒドロキシのPAAmハイドロゲルの調製

要約

私たちは、最小限のコストや専門知識を持つECMタンパク質の直接結合を可能にするヒドロキシPAAmを呼ばれる新しいポリアクリルアミドハイドロゲルを、提示します。マイクロコンタクトプリント法でヒドロキシ - のPAAmハイドロゲルの組み合わせは、細胞のmechanostransductionを研究するための天然の細胞の微小環境の多くの手がかりを独立して制御を容易にします。

要約

現在では、多くの細胞機能は、それらの細胞外マトリックス（ECM）環境の物理化学的および機械的な手がかりを用いた細胞の相互作用によって調節されることが確立されている。真核細胞は、常に、遺伝子発現の特定の変化を達成するために、生化学的シグナルにECMの物理的変化を形質導入し、これらの信号を統合するために、表面mechanosensorsを通じて局所微小環境を感知する。興味深いことに、互いにECM缶のカップルの物理化学的及び機械的パラメータは、細胞の運命を調節する。そのため、メカノを理解する鍵は、細胞機能上のECM手がかりの相対的な寄与を分離することです。

ここでは、迅速かつ容易にin vitroでのメカノ手がかりから独立チューニングのための生物学的に関連するヒドロゲルを生成するために、詳細な実験プロトコルを提示します。私たちは化学的に修飾されたポリアクリルアミドハイドロゲル（PAAmを）は、それらの本質的に非adhesを克服するために重合中にヒドロキシル官能アクリルアミドモノマーを組み込むことによって特性をアイブ。私たちは、ECMタンパク質の任意の所望の性質の固定化を可能にするヒドロキシPAAmを呼ばれる小説のPAAmハイドロゲルを、取得した。マイクロコンタクトプリンティング、ヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルの組み合わせは、独立して、単一細胞の形態、マトリックス剛性、性質およびECMタンパク質の濃度を制御することを可能にする。私たちは、in vitro細胞メカノ過程で勉強するすべての生物学の実験室で設定することができ、簡単で迅速な方法を提供する。今後は、ECMの剛性と核との間の機械的結合を実証する内皮細胞上の実験を行うことにより、この新規二次元のプラットフォームを検証します。

概要

局所的な細胞微小環境（ 例えば 、剛性、細孔径、タンパク質の性質、または細胞リガンド密度）の多くの局面は、運動性、細胞増殖、分化、および遺伝子発現のような細胞プロセスを制御する調節手がかりの座標セットを提供する。細胞外環境の物理化学的特性の改変は、細胞によって認識されると細胞の分極の変形、移動、および分化を含む、異なる生理学的結果を引き起こすことができる。これは、細胞が細胞の生化学的シグナルにECMの変更を変換する方法が、依然として不明である。したがって、主要な重要性メカノ経路を研究するための細胞とそれらの微小環境との間の相互作用を再現できるin vitroでの微小環境を制御操作することである。この問題に対処するために、容易に二ダイムを生成するために、ヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルと呼ばれる新規な方法^1を 、最近導入されている独立して重要なメカノキューを制御することが可能とnsionalソフト行列：行列のこわばり、セルの形状と閉じ込め、タンパク質の性質および細胞リガンド密度。

ECMはモルフォゲン（走化性）における勾配、接着性タンパク質（走触性）、および剛性（durotaxis）を介して細胞プロセスを指示します。過去数十年にわたり、in vitroでのプラットフォームの高度は、細胞が生理学的プロセス^2-5に生化学的および生物物理学的特徴を翻訳することができますどのように引き出すために、これらの細胞外の合図を分離するために開発されてきた。電子ビーム^6、フォトリソグラフィー^7、光化学固定化^8、またはプラズマ支援技法^9は、マイクロパターン化基体上の生きている細胞の増殖を導くために開発されてきた。これらの技術は重要な結果が得られているが、それらのほとんどが細胞挙動に対する異なる手がかりの個別の影響の間の識別を許可しない彼らはいくつかの研究室は余裕ができるという技術的設備を必要とします。これらの技術の中でも、マイクロコンタクトプリント（μCP）は、細胞接着性ミクロの島^10を作成するために、堅牢でアクセス可能な方法として浮上している。より最近では、多大な努力^11-14は、生体組織において観察された剛性の広い範囲を再現するために調整可能な剛性を有するヒドロゲルでμCPの開発がなされてきた。これらの作品の中では、ポリアクリルアミド（PAAmを） ^を15普及し、すでに細胞バイオメカニクスアッセイのための最も一般的に使用されるポリマーベースのマトリックスの1つになっています。

PAAmを表面は一般的にN-スルホスクシンイミジル-6 - [4'-アジド-2'-nitrophenylamido]（スルホ-SANPAH）およびECMタンパク質は、スルホ-SANPAHニトロフェニルのUV活性化により表面に結合されているヘテロ二官能性架橋剤で官能化されアジド基^16。別の技術は深刻な酸化されたタンパク質に結合ヒドラジンから成るヨウ素酸^17。ハインドらはアクロイル-ストレプトアビジンモノマー¹⁸の存在下での光重合を必要とするタンパク質およびペプチドと生体模倣ハイドロゲルの表面をパターン化するための技術を導入した。より最近では、ツェンらは、1 -エチル-3 - [3 -ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDC）で活性化PAゲルをインキュベートするために必要な光学石英マスクを通してのPAAmのディープUV露光に基づいて新しい微細方法^19を報告しているタンパク質を追加する前とN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）水溶液。長い合成方法（ 例えば 、透析、凍結乾燥など）、高価な化学化合物（ 例えば 、ヒアルロン酸、スルホ-SANPAH）または深UV：均質で再現性のあるタンパク質の微細パターンを作成するためにこれらの技術の能力にもかかわらず、それらのほとんどは、主要な制限を被る照射。また、これらの技術は、基板の剛性の独立した変調、微細パターンを許可しないジオメトリ、ECMタンパク質の性質、および細胞 - リガンド密度。

考慮にこれらの制限を考えると、私たちはソフトハイドロゲル上のタンパク質および生体分子の多様性の固定化を可能にし、細胞機能に及ぼす役割を解読するために、メカノキューとは独立してチューニングを可能にする新規かつシンプルなアクリルアミドベースのアプローチを開発しました。代わりに過酷な化学的化合物とのPAAmヒドロゲルの治療は、PAAmを重合中のヒドロキシル基を有する市販のアクリルアミドモノマーを導入する。この単純な操作は、他の技術的な要件なしのPAAmハイドロゲルの固有抗接着性を克服する。

水酸基の存在は水素結合相互作用を形成するタンパク質および生体分子のためのヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルの高い親和性をもたらす。 μCPと組み合わせて、ヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルは、独立した制御を備え​​た二次元培養プラットフォームの迅速な生成を可能にするメカノを研究するための強力なプラットフォームであると想定されているマトリックスの剛性、ECMタンパク質の種類、細胞リガンド密度と閉じ込められた接着性、オン。

このプロトコルの目的は、容易に材料科学の専門知識を持たない任意のヒドロキシPAAmをヒドロゲルを作製するために必要な情報を提供することにある。研究者は病態生理学的メカニズムに関与してメカノ経路のより良い理解につながる可能性が細胞および組織レベルでの生理学的に関連する質問をするための究極の目標は、手段を提供することである。

プロトコル

1ガラスカバースリップの表面を活性化

1. ペトリ皿とスミア（推奨化学ヒュームフード）で5分間、その上に、0.1MのNaOH溶液中でガラスの円形カバースリップ（直径25mm）。
2. NaOH溶液を外し、静かに無菌培養フード内で揺動板に揺動しながら、完全に20分間、無菌のddH ₂ Oでカバースリップを浸す。
3. 無菌のddH ₂ Oを排出し、ステップ1.2を繰り返します。
4. 無菌ピンセットでカバーガラスを取り外して、活性化した顔を上にして新しいペトリ皿に配置します。
5. 高純度窒素ガスの定常流の下で乾燥したカバースリップ。
6. 無菌培養フードでは、1時間カバースリップの活性化された側の3-（トリメトキシシリル）プロピルアクリレート（92％）の薄層を汚す。
7. 広範囲に無菌のddH ₂ Oを3回洗浄したカバーガラスを洗浄し、新しいシャーレに無菌のddH ₂ Oでそれらを浸す。
8. ペトリ皿をタップそしてパラフィルムで10分間穏やかに攪拌しながらロッカープレートの上に置きます。
9. 細かいヒントを、滅菌ピンセットでのddH ₂ Oからのカバーガラスを取り外して、活性化した顔を上にして新しいペトリ皿に配置します。
10. カバーガラスに付着するほこりを避けるために、アルミホイルで乾燥した場所に、室温で保管してください。

ヒドロキシのPAAmハイドロゲルの調製

1. 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブ中のN-ヒドロキシエチルアクリルアミド（HEA）65mgの重量を準備します。それは、新鮮なHEA溶液を調製することが重要です。
2. HEAに50mMのHEPES緩衝液1mlを加え、完全に溶解するまでのHEAボルテックスを使って混ぜる。
3. 希望ヒドロゲルの剛性に到達するために（ 表1参照）のHEPESアクリルアミド溶液およびHEPESビスアクリルアミド溶液中のw / wの2％の必要な数量のw / wの40％の400を添加する。最終容量5mlに50 mMのHEPESで調整する。
4. ボルテックスと脱ガスを使用して溶液を混ぜるヒドロキシ-PAAmを重合を防止し、溶液内の酸素濃度を減少させるために20分間真空チャンバー内。
5. 無菌フード下では、それを滅菌するために、0.2μmの孔径のフィルターと脱気溶液を濾過。
6. 7分間のUV /オゾンクリーナー円形カバーガラス（直径22mm）をアクティブにします。
7. 10％硫酸アンモニウム（APS）溶液100μlを準備し、それを100μlのddH ₂ O中に10mgのAPSですこれは、新鮮なAPS溶液を調製することが重要である。
8. 重合を開始し滅菌ヒドロキシのPAAm溶液（ステップ2.5）にテトラメチレンジアミン2.5μlの（TEMED）とAPS溶液25μlを追加します。無菌条件下で、気泡を導入せずに3連続したピペッティングにより溶液を混ぜる。
9. 無菌フード下では、（ステップ1.9から入手可能）25mmのカバースリップ上のヒドロキシのPAAm溶液25μl滴を配置し、すぐに22ミリメートルGLを置くヒドロキシ-PAAmをソリューションを絞る液滴の上に（ステップ2.5に調製した）お尻のカバースリップ。無菌ピンセットで22ミリメートルのガラス製カバースリップを中央にして気泡を滑らかに。
10. ヒドロキシのPAAmハイドロゲルは、室温で15分間重合させた。重合プロセスの完了を追跡する手動エッペンドルフチュー​​ブ内の残りのヒドロキシのPAAm水溶液を反転させる。
11. 完全無菌のddH ₂ Oでカバーガラスを浸すと、慎重に22ミリメートルのガラス製カバースリップおよびヒドロキシのPAAmハイドロゲル層との間にカミソリの刃のエッジを導入することにより、22ミリメートルのカバーガラスを分離する。
12. 滅菌PBS（PBSの3取引所）とヒドロキシのPAAmハイドロゲルを洗浄し、ゲルが完全に水分補給を維持するために、無菌PBS中に浸漬してみましょう。
13. 最大3日間4℃で滅菌PBS中のヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルに保管してください。

3ポリジメチルシロキサン（PDMS）Microstamp製作

注：シリコンマスターの製造は、駅の前に必要とされるPDMSのmicrostamp製造を室温。シリコンマスターのこの微細加工は、特殊な装置や訓練を必要リソグラフィ技術によって行うことができる。ナノ加工施設とのコラボレーションは、シリコンマスターを製作することをお勧めします。代わりに、オンデマンドでカスタムメイドの微細構造のシリコンマスターを製作する会社に連絡してください。これは、シリコンマスターの製造は一度だけ実行される必要があることに留意することが重要である。実際に、微細構造のシリコンマスターが、エラストマースタンプを生成するために無期限に使用することができる。

1. 10にPDMSと硬化剤を混合する：プラスチックビーカー中に1の比率で10分間、ピペットを用いて完全に混合する。
2. ステップ3.1の間に形成された気泡を除去するために真空下でPDMS混合物を脱気。
3. シャーレ内の微細構造のシリコンマスターを配置し、気泡を形成することなく、その上に脱気したPDMS混合物の10 mmの厚さの層をキャスト。
4. で、60℃で2時間、PDMSを治すLETオーブン。
5. ほこりのない環境では、剥離PDMS層と物品税メスで1cm ^2の microstamps。
6. 鉗子を使用して、場所PDMSをペトリ皿にパターンアップmicrostamps。

4。マイクロパターニングヒドロキシ - のPAAmハイドロゲル

1. 15分間のエタノール/水（50:50）溶液中超音波処理中に置きのPDMS microstampsを。
2. 窒素流流でスタンプを乾燥させ、それらを7分間UV /オゾンクリーナーパターンアップ（λ<200 nm）を配置します。
3. 無菌フード下で、1cmの² PDMSスタンプの微細構造表面上に所望のタンパク質溶液（ 例えば 、100μg/ mlのラミニンPBS中または25 / mlのフィブロネクチンPBS中）の150μlのドロップを置きます。
4. オプション：細胞 - リガンド密度を調節するために、タンパク質溶液の濃度を変更します。
5. の各コーナーに向かってピペットの先端を無菌でそれを移動させることによって、スタンプ表面を横切るタンパク質溶液を広げるスタンプ。
6. 無菌フード下で60分間PDMSスタンプに吸着するタンパク質溶液のままにしておきます。タンパク質損傷を避けるため、ランプをオフにします。
7. 無菌フード下では、ペトリ皿に（ステップ2.13から入手可能）、ヒドロキシPAAmをコーティングしたカバースリップを転送します。
8. 無菌条件下での低窒素流でヒドロキシ-PAAmを基材の表面から過剰のPBSを削除します。とすぐにゲル表面に水を立っての証拠が観察されないように手続きを停止します。ゲルは、この段階で完全に乾燥してはならない。
9. 乾燥は、慎重にPDMSの構造化表面は、高純度窒素ガスの定常流でスタンプ。
10. ドレッシング組織鉗子を用いたタンパク質でコーティングされたスタンプをつかみ、乾燥したハイドロゲル表面に接触して構造化した表面に置きます。スタンプマイクロ構造およびヒドロゲル表面との間の良好な接触を確保するためにPDMSスタンプの上にピンセットの先端で簡単な圧力ポイントを適用します。
11. 目の上のPDMSスタンプのままに室温で1時間の電子化ヒドロゲル表面。
12. 静かにドレッシング組織鉗子でヒドロキシ - のPAAmハイドロゲルからPDMSスタンプを削除して、スタンプをきれいにするステップ4.1に従ってください。
13. 為替当たり10分間、無菌状態でのPBS 3の交換液（pH = 7.4）によって広く刻印ヒドロキシPAAmをハイドロゲルを洗ってください。
14. オプション：他のECMタンパク質のさらなる微細パターンは、ステップ4.11〜4.5に従うことによってヒドロキシPAAmを表面に添加することができる。
15. ロッキングプレート上穏やかな撹拌下、4℃で1夜の間に、PBS中5mg / mlのBSAの無菌溶液で不動態化非印刷ゾーン。
16. 交換につき10分間滅菌条件下でのPBS 3の交換液（pH = 7.4）で広く洗浄します。この段階では、スタンプさヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルは、一週間まで4℃で保存することができる。

マイクロパターンヒドロキシPAAmをヒドロゲル上の5の細胞沈着

1. めっき前cに30〜45分間、細胞培地中でカバースリップをインキュベートのエル。
2. 37℃で滅菌したPBSで75cm ^2の培養フラスコで培養接着細胞を洗浄し、トリプシン-EDTAまたは10分間ACCUTASE 3mlで、それを取り外してください。
3. 650のx gで3分間、細胞懸濁液を遠心分離した細胞を含むフラスコにあなたの細胞株についての予め温めた完全増殖培地に適切な所望の量を転送する。
4. マイクロピペットで上清を除去し、15-20,000細胞/ mlで完全培地中で細胞を懸濁します。
5. （ステップ5.1から得られた）マイクロパターン化カバースリップに細胞溶液4mlを加え、37℃で培養インキュベーター中で細胞に覆われたカバースリップを置き、1〜2時間、5％の湿度。
6. 吸引し優しく付着していない細胞と培養液を交換してください。インキュベーターに付着した細胞を戻し、それらを（細胞型に応じて、3〜6時間）完全に広げてみましょう。

結果

図1Aは、ランダムラジカル重合によって埋め込 ​​まヒドロキシル基（水酸基のPAAm）、ポリアクリルアミドの親水性ネットワークを形成された一次ヒドロキシル基を含むN-ヒドロキシエチル（HEA）モノマーとアクリルアミドの共重合（AAM）を提示し、ビスアクリルアミド（ビス-AAmと） 。このプロトコルでは、HEAの重量65 mgのHEPESの1ミリリットルの容量で希釈しなければならない...

ディスカッション

現代の細胞生物学のin vitroでの観察の多くは、多くの場合、ECMタンパク質またはRGD配列を含む合成ペプチドの薄層で被覆された硬質ガラス製カバースリップ上で行われている。しかし、そのような基本的な培養基質は、細胞のメカノプロセスを研究するための正確なモデルを提供しないので、ECMの全体の物理化学の複雑さを再現していません。この問題に取り組むために、任意の所望?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
UV/Ozone Photoreactor	Ultra-Violet Products	Model PR-100
Rocking plate	IKAcWerke	Model KS 130 Basic
Vortexer	Scientific Industries	Model Vortex Genie2
Vacuum degassing chamber	Applied Vacuum Engineering	DP- 8-KIT
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
Stainless steel forceps with fine tip	Sigma-Aldrich	Z225304-1EA
Dressing tissue forceps	Sigma-Aldrich	F4392-1EA
Petri dishes in polystyrene	Sigma-Aldrich	P5731-500EA
Aluminium foil, thickness 0.5 mm	Sigma-Aldrich	266574-3.4G
Isopore membrane filter (0.2 µm pore size)	Millipore	GTTP Filter code
Round glass coverslip (22 mm diameter)	Neuvitro	GG-22
Round glass coverslip (25 mm diameter)	Neuvitro	GG-25
Variable volume micropipette	Sigma-Aldrich	Z114820
Protein microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	Z666505-100EA
Scalpel handles	Sigma-Aldrich	S2896-1EA
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2771-100EA
Cell culture flasks (75 cm2)	Sigma-Aldrich	CLS430641
Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel)	Sigma-Aldrich	Z613983-1EA
Polydimethylsiloxane	Dow Corning	Sylgard 184 silicone elastomer kit
Acrylamide (powder)	Sigma-Aldrich	A3553
N,N’-Methylenebis(acrylamide)	Sigma-Aldrich	146072
N-Hydroxyethylacrylamide	Sigma-Aldrich	697931
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
Amonium PerSulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate	Sigma-Aldrich	1805
Human Plasma Fibronectin	Millipore	FC010
Laminin from EHS	Sigma-Aldrich	L2020
Sodium hydroxyde	Sigma-Aldrich	221465-25G
Double-distilled water (ddH2O)
Endothelial cell growth medium	Cells Applications	211K-500
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Invitrogen	C-003-5C
Accutase	PAA laboratories	L11-007
HEPES buffer solution 1 M in H2O	Sigma-Aldrich	83264-500ML-F
Antibiotics-antimycotics	PAA laboratories	P11-002
Phosphate Buffer Saline solution	PAA laboratories	H15-002
Alexa Fluor 488 Phaloidin	Molecular Probes	A12379
Anti-vinculin antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	V9131
Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine	Molecular Probes	T-2762
Anti-Fibronectin (rabbit)	Sigma-Aldrich	F3648
Streptavidin	Sigma-Aldrich	41469
Anti-Laminin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	L9393
Anti-rabbit IgG-FITC	Sigma-Aldrich	F7512
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924-100ML
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	459844-2.5L