הכנת הידרוקסי-PAAm הידרוג לצימוד האפקטים של רמזי mechanotransduction

Summary

אנו מציגים הידרוג'ל חדש polyacrylamide, נקרא הידרוקסי-PAAm, המאפשר ישיר מחייב של חלבוני ECM עם עלות או מומחיות מינימאלית. שילוב של הידרוקסי-PAAm הידרוג עם הדפסת microcontact מאפשרת שליטה עצמאית של רמזים רבים של microenvironment התא הטבעי ללימוד mechanostransduction הסלולרי.

Abstract

עכשיו זה גם נקבע כי רב תפקודים תאיים מוסדרים על ידי יחסי גומלין של תאים עם רמזי physicochemical ומכאניים של סביבתם מטריצת חוץ תאית (ECM). תאים האיקריוטים לחוש כל הזמן microenvironment המקומי שלהם באמצעות mechanosensors משטח כדי transduce שינויים פיזיים של ECM לאותות ביוכימיים, ולשלב את האותות האלה להשגת שינויים ספציפיים בביטוי גנים. מעניין, פרמטרים physicochemical ומכאניים של בני הזוג יכול ECM אחד עם השני כדי להסדיר את גורל תא. לכן, מפתח להבנת mechanotransduction הוא לנתק את תרומתו היחסית של רמזי ECM על תפקודים תאיים.

כאן אנו מציגים פרוטוקול ניסוי מפורט במהירות ובקלות ליצור הידרוג רלוונטי מבחינה ביולוגית לכוונון העצמאי של רמזי mechanotransduction במבחנה. אנו הידרוג polyacrylamide שינוי כימי (PAAm) להתגבר באופן מהותי שאינו adhesive נכסים על ידי שילוב מונומרים acrylamide-פונקציונליות הידרוקסיל במהלך פילמור. השגנו הידרוג'ל רומן PAAm, נקרא הידרוקסי-PAAm, המאפשר קיבוע מכל הסוג רצוי של חלבוני ECM. שילוב של הידרוקסי-PAAm הידרוג עם הדפסת microcontact מאפשרת לשלוט באופן עצמאי את המורפולוגיה של תאים בודדים, נוקשות המטריצה, הטבע והצפיפות של חלבוני ECM. אנו מספקים שיטה פשוטה ומהירה שניתן להגדיר בכל מעבדת ביולוגיה ללמוד בתהליכי mechanotransduction תא מבחנה. אנו מאשרים הרומן הזה פלטפורמה דו ממדים על ידי ביצוע ניסויים על תאי האנדותל המדגימים צימוד מכאני בין נוקשות ECM והגרעין.

Introduction

היבטים של microenvironment הסלולרי המקומי רבים (למשל, קשיחות, גודל נקבובית, טבע של חלבונים, או צפיפות תאים ליגנד) לספק קואורדינטות מוגדרות של רמזי רגולציה השולטים בתהליכים תאיים כגון תנועתיות, התפשטות תאים, התמיינות, וביטוי גנים. שינויים של מאפייני physicochemical של הסביבה תאית יכולים להיתפס על ידי תאים ולגרום להשלכות פיסיולוגיות שונות, כולל עיוות של קיטוב סלולארי, הגירה, ובידול. עדיין לא ברור, עם זאת, כיצד תאים לתרגם שינויי ECM לאותות ביוכימיים סלולריים. לכן חשיבות רבה למהנדס בשליטה בmicroenvironments מבחנה שיכולה לשכפל את יחסי הגומלין בין תאים וmicroenvironment ללימוד מסלולי mechanotransduction. כדי לטפל בבעיה זו, יש לנו לאחרונה הציג שיטה חדשה ^1, הנקראת הידרוג-PAAm הידרוקסי, כדי ליצור שתי אגורה בקלותמטריצות nsional רכות המאפשרות לשלוט באופן עצמאי רמזי mechanotransduction חשובים: מטריצת קשיחות, גיאומטריה תא וכליאה, הטבע של החלבון וצפיפות תאים ליגנד.

ECM מכוון את התהליכים תאיים באמצעות הדרגתיים בmorphogens (chemotaxis), חלבוני דבק (haptotaxis), וקשיחות (durotaxis). במהלך העשורים האחרונים, מתקדם בפלטפורמות מבחנה פותחו כדי לבודד רמזים תאיים הללו על מנת להקניט את הדרך בה התאים מסוגלים לתרגם תכונות ביוכימיות וbiophysical לתהליכים פיסיולוגיים ^2-5. אלומת אלקטרונים ^6, photolithography ^7, קיבוע פוטו ^8, או טכניקות סיוע פלזמה ⁹ פותחו כדי לכוון את הצמיחה של תאי חיים על מצעי micropatterned. למרות שהטכניקות אלה הניבו תוצאות חשובות, רובם אינו מאפשרים אפליה בין ההשפעה הפרטנית של רמזים שונים על התנהגות תאוהם דורשים מתקנים טכניים שכמה מעבדות יכולות להרשות לעצמו. בין הטכניקות הללו, הדפסת microcontact (μCP), התפתחה כשיטת חזקה ונגישה ליצירת מיקרו איי תא מודבק ^10. לאחרונה, מאמצים נרחבים ^11-14 נעשה כדי לפתח μCP על הידרוג'ל עם קשיחויות מתכונן כדי לשחזר את מגוון הרחב של קשיחויות שנצפו ברקמות חיות. בין יצירות אלה, polyacrylamide (PAAm) הפך פופולרי ¹⁵ והוא כבר אחד המטריצות המבוסס על פולימר הנפוץ ביותר עבור מבחני ביומכניקה התא.

משטחי PAAm הם פונקציונליות בדרך כלל עם מקשר הצולב heterobifunctional החלבונים sulfosuccinimidyl-6 N [4'-azido-2'-nitrophenylamido] (sulfo-SANPAH) וECM צמודים למשטח על ידי הפעלת UV של nitrophenyl sulfo-SANPAH קבוצות אזיד ^16. טכניקה נוספת מורכבת בהידרזין צימוד לחלבונים שעברו חמצון קשהעם periodate ^17. Hynd ועמיתים לעבודה הציגו טכניקה עבור דפוסי משטחי הידרוג'ל biomimetic עם חלבון ופפטידים הדורשת photopolymerization בנוכחות של מונומר acroyl-streptavidin ^18. לאחרונה, Tseng et al. דיווחו שיטה חדשה micropatterning ¹⁹ מבוססים על חשיפה לקרינת UV עמוקה של PAAm דרך מסכת קוורץ אופטית הדורשת לדגירת ג'לי הרשות הפלסטינית מופעל עם 1-אתיל-3 [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) ופתרונות N-hydroxysuccinimide (NHS) מים לפני להוסיף את החלבון. למרות היכולת של טכניקות אלה כדי ליצור micropatterns חלבונים הומוגנית ושחזור, רובם סובלים מגבלות עיקריות: תהליכי סינתזה ארוכה (למשל, דיאליזה, lyophilization, וכו '), תרכובות כימיות יקרות (למשל, חומצה היאלורונית, sulfo-SANPAH) UV עמוק או הקרנה. בנוסף, טכניקות אלה אינן מאפשרות אפנון עצמאי של קשיחות מצע, micropatternגיאומטריה, טבע חלבון ECM, וצפיפות תאים ליגנד.

לוקח מגבלות אלה בחשבון, שפיתחנו גישה המבוססת על acrylamide רומן ופשוט, המאפשרת קיבוע של מגוון רחב של חלבונים ומולקולות ביולוגיים על הידרוג רך ומאפשרת כוונון עצמאי של רמזי mechanotransduction כדי לפענח את תפקידם על תפקודים תאיים. במקום לטפל הידרוג PAAm עם תרכובות כימיות קשות, אנחנו מציגים מונומר acrylamide מסחרי עם קבוצות הידרוקסיל במהלך פילמור PAAm. פעולה פשוטה זו מתגברת על הרכוש אנטי דבק הפנימי של הידרוג PAAm ללא כל דרישות טכניות אחרות.

הנוכחות של קבוצות הידרוקסיל מובילה לזיקה גבוהה של הידרוג-PAAm הידרוקסי לחלבונים ומולקולות ביולוגיים היוצרים אינטראקציות מימן מליטה. בשילוב עם μCP, הידרוג-PAAm הידרוקסי לאפשר דור מהיר של פלטפורמת התרבות דו ממדים עם שליטה עצמאיתעל קשיחות מטריצה, סוג של חלבוני ECM, צפיפות תאים ליגנד ודביקות מוגבלת, אשר חזתה להיות פלטפורמה רבת עוצמה ללימוד mechanotransduction.

מטרת פרוטוקול זה היא לספק את המידע הדרוש בקלות מה שהופך את הידרוג-PAAm הידרוקסי ללא מומחיות כלשהי במדעי חומר. המטרה הסופית היא לספק אמצעים לחוקרים לשאול שאלות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית ברמה התאית ורקמות שעשויות להוביל להבנה טובה יותר של מסלולי mechanotransduction המעורבים במנגנוני pathophysiological.

Protocol

.1 הפעלת Surface של Coverslips הזכוכית

1. coverslips זכוכית מקום עגול (25 מ"מ קוטר) בצלחת פטרי ולמרוח 0.1 פתרון M NaOH על זה במשך 5 דקות (מנדף הכימי המומלץ).
2. הסר את פתרון NaOH ולטבול באופן מלא coverslips עם סטרילי DDH ₂ O עבור 20 דקות תוך מתנדנד בעדינות על צלחת נדנדה בברדס תרבות סטרילי.
3. מסננים DDH ₂ O סטרילי ולחזור על השלב 1.2.
4. הסר את coverslips עם פינצטה סטרילי ולמקם אותם בצלחת פטרי חדשה עם מופעל עם הפנים למעלה.
5. coverslips יבש תחת זרימה קבועה של גז חנקן טוהר גבוה.
6. במנדף תרבות סטרילי, למרוח שכבה דקה של 3 acrylate propyl (trimethoxysilyl) (92%) בצד הופעל של coverslip עבור שעה 1.
7. בהרחבה לשטוף coverslips זכוכית עם 3 שוטף של DDH סטרילי ₂ O ולטבול אותם בסטרילי DDH ₂ O בצלחת פטרי חדש.
8. הקש על צלחת פטריעם Parafilm ומניח אותו על צלחת נדנדה תחת תסיסה עדינה עבור 10 דקות.
9. הסר את coverslips מDDH ₂ O עם פינצטה סטרילי עם טיפים יפים ומניח אותם בצלחת פטרי חדשה עם מופעל עם הפנים למעלה.
10. לאחסן ב RT במקום יבש עם נייר אלומיניום כדי למנוע אבק יידבק לcoverslips.

2 הכנת הידרוקסי-PAAm הידרוג

1. הכן משקל של 65 מ"ג של acrylamide N-Hydroxyethyl (HEA) בצינור 1.5 Eppendorf מ"ל. חשוב להכין פתרון HEA טרי.
2. הוסף 1 מ"ל של 50 חיץ HEPES מ"מ לHEA ולערבב באמצעות vortexer עד פירוק HEA המלא.
3. הוספת 400 μl של 40% w / w בHEPES פתרון acrylamide והנפח הנדרש של 2% w / w בפתרון bis-acrylamide HEPES (ראה טבלה 1) כדי להגיע לנוקשות הידרוג'ל הרצויות. התאם עם 50 HEPES מ"מ לנפח סופי של 5 מ"ל.
4. מערבבים את הפתרון באמצעות vortexer ודגה זהבתא ואקום עבור 20 דקות כדי להפחית את ריכוז חמצן בתוך התמיסה, אשר מונעת פילמור הידרוקסי-PAAm.
5. מתחת למכסת מנוע סטרילי, לסנן פתרון degased עם מסנן גודל נקבובית 0.2 מיקרומטר כדי לעקר אותה.
6. הפעל coverslips העגול זכוכית (קוטר 22 מ"מ) בשואב UV / אוזון במהלך 7 דקות.
7. הכן 10% persulfate אמוניום פתרון (APS) 100 μl, שהוא 10 APS מ"ג ב100 μl DDH ₂ O. חשוב להכין פתרון APS טרי.
8. הוסף 2.5 μl של tetramethylenediamine (TEMED) ו25 μl של פתרון APS לפתרון מעוקר הידרוקסי-PAAm (שלב 2.5) ליזום פילמור. מערבבים את הפתרון על ידי 3 pipettings רצוף ללא הקדמה של בועות, בתנאים סטריליים.
9. מתחת למכסת מנוע סטרילי, מקום טיפת 25 μl של פתרון הידרוקסי-PAAm על coverslip 25 מ"מ (זמינה מצעד 1.9) ומייד להציב GL 22 מ"מcoverslip התחת (שהוכן על שלב 2.5) על גבי אגל לסחוט את פתרון הידרוקסי-PAAm. מרכז את coverslip זכוכית 22 מ"מ עם פינצטה סטרילי ולהחליק את כל בועות.
10. לאפשר הידרוג-PAAm הידרוקסי לפלמר ב RT במשך 15 דקות. היפוך ידני פתרון הידרוקסי-PAAm שנותר בצינור Eppendorf לעקוב השלמת תהליך פילמור.
11. באופן מלא לטבול coverslips עם סטרילי DDH ₂ O ולהפריד בזהירות את 22 coverslips מ"מ הזכוכית על ידי החדרת הקצה של סכין גילוח בין coverslips מ"מ הזכוכית 22 ושכבת הידרוג'ל הידרוקסי-PAAm.
12. לשטוף הידרוג-PAAm הידרוקסי עם PBS סטרילי (3 חילופים של PBS) ולתת לי ג'לי השקוע לחלוטין בPBS סטרילי כדי לשמור על לחות.
13. אחסן הידרוג-PAAm הידרוקסי בסטרילי PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 ימים.

.3 Polydimethylsiloxane (PDMS) Microstamp ייצור

הערה: הייצור של אדון סיליקון נדרשת לפני start PDMS ייצור microstamp. microfabrication זה של אדון סיליקון יכול להיעשות על ידי טכניקות ליתוגרפי, אשר דורשת ציוד והכשרה מיוחדים. שיתופי פעולה עם מתקן nanofabrication מעודדים לפברק מאסטר סיליקון. לחלופין, ליצור קשר עם חברה שבודה אדוני סיליקון microstructured מחוייט על פי דרישה. חשוב לציין כי הייצור של אדון סיליקון רק צריך להיעשות פעם אחת. ואכן, ניתן להשתמש בו אדוני סיליקון microstructured ללא הגבלת זמן לייצר חותמות אלסטומרי.

1. מיקס PDMS וסוכן הריפוי ב10: 1 יחס בכוס פלסטיק ומערבבים היטב בעזרת פיפטה עבור 10 דקות.
2. דגה תערובת PDMS תחת ואקום כדי להסיר בועות אוויר שנוצרו במהלך השלב 3.1.
3. הנח את אדון סיליקון microstructured בצלחת פטרי והטלת שכבה עבה 10 מ"מ של תערובת PDMS degassed על זה בלי ליצור בועות.
4. לאפשר לרפא PDMS לשעה 2 ב 60 מעלות צלזיוס בתנור.
5. בסביבה נטולת אבק, microstamps 1 סנטימטר ² מתקלפת שכבת PDMS ובלו עם אזמל.
6. בעזרת מלקחיים, PDMS המקום microstamps דפוס בצלחת פטרי.

.4 הידרוג הידרוקסי-PAAm Micropatterning

1. microstamps PDMS המקום באתנול / מים פתרון (50/50) וsonicate במשך 15 דקות.
2. ייבש את הבולים עם זרם של זרימת חנקן ולמקם אותם דפוס בשואב UV / אוזון (λ <ננומטר 200) במשך 7 דקות.
3. מתחת למכסת מנוע סטרילי, מקום טיפה 150-μl של פתרון רצוי חלבון (לדוגמא, 100 מיקרוגרם / laminin מיליליטר PBS או 25 מיקרוגרם / מ"ל פיברונקטין PBS) על גבי משטח microstructured של בול ² PDMS 1 סנטימטר.
4. אופציונאלי: שנה את הריכוז של תמיסת החלבון לווסת את צפיפות תאים ליגנד.
5. מורחים את פתרון החלבון על פני השטח החותמת על ידי הזזתו עם קצה סטרילי של פיפטה כלפי כל אחת מפינותהחותמת.
6. השאר את פתרון החלבון לספוג בחותמת PDMS ל60 דקות מתחת למכסת מנוע סטרילית. כבה את הנרות, כדי למנוע נזק חלבון.
7. תחת מכסה המנוע סטרילית, להעביר coverslips הידרוקסי-PAAm המצופה (ניתן להשיג בצעד 2.13) לתוך צלחת פטרי.
8. הסר PBS העודף מפני שטח של מצעי הידרוקסי-PAAm עם זרם חנקן נמוך בתנאים סטריליים. להפסיק את ההליך בהקדם אין ראיות של מים עומדים על פני השטח ג'ל הוא ציין. ג'ל לא צריך להיות יבש לחלוטין בשלב זה.
9. יבש בזהירות את פני השטח המובנה של PDMS להחתים עם זרימה קבועה של גז חנקן טוהר גבוה.
10. לתפוס את החותמת מצופה חלבון עם מלקחיים רקמות הלבשה ולמקם את פני השטח המובנה במגע עם פני השטח הידרוג'ל המיובשים. החל נקודות לחץ קצרות עם הקצה של פינצטה בחלק העליון של חותמת PDMS כדי להבטיח קשר טוב בין microfeatures בולים ופני שטח הידרוג'ל.
11. השאר את חותמת PDMS על המשטח הידרוג'ל דואר עבור שעה 1 ב RT.
12. להסיר בעדינות בולי PDMS מהידרוג הידרוקסי-PAAm עם מלקחיים רקמות הלבשה ובצע את השלב 4.1 לנקות את החותמת.
13. לשטוף בהרחבה הידרוג-PAAm הידרוקסי יוחתם על ידי 3 חילופים של PBS (pH = 7.4) בתנאים סטריליים עבור 10 דקות לחליפין.
14. אופציונאלי: micropatterns נוסף של חלבוני ECM אחרים ניתן להוסיף למשטח הידרוקסי-PAAm ידי ביצוע שלבים 4.5-4.11.
15. אזורים מודפסים אינו passivate עם פתרון סטרילי של BSA ב5 מ"ג / מיליליטר PBS במהלך לילה אחד ב 4 מעלות צלזיוס תחת תסיסה עדינה על צלחת נדנדה.
16. לשטוף בהרחבה על ידי 3 חילופים של PBS (pH = 7.4) בתנאים סטריליים עבור 10 דקות לחליפין. בשלב זה, ניתן לאחסן הידרוג-PAAm הידרוקסי חותמת על 4 מעלות צלזיוס עד שבוע.

.5 הפקדת נייד על הידרוקסי-PAAm הידרוג micropatterned

1. דגירה coverslips בתקשורת תא ל30-45 דקות לפני הציפוי גאמות.
2. שטוף תאים חסיד תרבותיים בבקבוק ² תרבות 75 סנטימטר עם PBS סטרילי על 37 מעלות צלזיוס ולנתק אותו עם 3 מ"ל של טריפסין-EDTA או Accutase עבור 10 דקות.
3. להעביר את הסכום הרצוי של מדיום גידול מתאים מלא מראש חימם עבור הקו הסלולרי שלך לתוך הבקבוק המכיל את התאים מנותקים וצנטריפוגה ההשעיה התא במשך 3 דקות ב650 x גרם.
4. הסר את supernatant עם micropipette וresuspend התאים במדיום התרבות שלם ב15-20,000 תאים / מ"ל.
5. הוסף 4 מ"ל של פתרון התא לcoverslip micropatterned (המתקבל משלב 5.1) ומקום coverslip מכוסה התא בחממה תרבות ב37 ° C ו 5% לחות ל1-2 שעות.
6. לשאוב בעדינות תאים ופנויים להחליף מדיום התרבות. להחזיר את התאים המצורפים לחממה ולתת להם להתפשט באופן מלא (שעות 3-6, תלוי בסוג התא).

תוצאות

איור 1 א מציג את שיתוף פילמור של acrylamide (AAM) וbisacrylamide (bis-עאם) עם N-hydroxyethylacrylamide מונומרים (HEA) המכילים הידרוקסיל עיקרי שהוקם על ידי פילמור הרדיקלי האקראי רשת הידרופילי של polyacrylamide עם קבוצות הידרוקסיל משובצות (הידרוקסי-PAAm) . בפרוטוקול זה, מ"ג משקל 65 של חימום חייב להי...

Discussion

רב בתצפיות מבחנה בביולוגיה של התא מודרני בוצעו על coverslips זכוכית הקשיח, לעתים קרובות מצופה בשכבה דקה של חלבוני ECM או פפטידים סינטטיים המכילים את רצף RGD. עם זאת, מצעי תרבות בסיסיים כגון לא לשחזר את כל מורכבות physicochemical של ECM ולכן אינם מספקים מודל מדויק ללימוד תהליכי mecha...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UV/Ozone Photoreactor	Ultra-Violet Products	Model PR-100
Rocking plate	IKAcWerke	Model KS 130 Basic
Vortexer	Scientific Industries	Model Vortex Genie2
Vacuum degassing chamber	Applied Vacuum Engineering	DP- 8-KIT
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
Stainless steel forceps with fine tip	Sigma-Aldrich	Z225304-1EA
Dressing tissue forceps	Sigma-Aldrich	F4392-1EA
Petri dishes in polystyrene	Sigma-Aldrich	P5731-500EA
Aluminium foil, thickness 0.5 mm	Sigma-Aldrich	266574-3.4G
Isopore membrane filter (0.2 µm pore size)	Millipore	GTTP Filter code
Round glass coverslip (22 mm diameter)	Neuvitro	GG-22
Round glass coverslip (25 mm diameter)	Neuvitro	GG-25
Variable volume micropipette	Sigma-Aldrich	Z114820
Protein microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	Z666505-100EA
Scalpel handles	Sigma-Aldrich	S2896-1EA
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2771-100EA
Cell culture flasks (75 cm2)	Sigma-Aldrich	CLS430641
Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel)	Sigma-Aldrich	Z613983-1EA
Polydimethylsiloxane	Dow Corning	Sylgard 184 silicone elastomer kit
Acrylamide (powder)	Sigma-Aldrich	A3553
N,N’-Methylenebis(acrylamide)	Sigma-Aldrich	146072
N-Hydroxyethylacrylamide	Sigma-Aldrich	697931
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
Amonium PerSulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate	Sigma-Aldrich	1805
Human Plasma Fibronectin	Millipore	FC010
Laminin from EHS	Sigma-Aldrich	L2020
Sodium hydroxyde	Sigma-Aldrich	221465-25G
Double-distilled water (ddH2O)
Endothelial cell growth medium	Cells Applications	211K-500
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Invitrogen	C-003-5C
Accutase	PAA laboratories	L11-007
HEPES buffer solution 1 M in H2O	Sigma-Aldrich	83264-500ML-F
Antibiotics-antimycotics	PAA laboratories	P11-002
Phosphate Buffer Saline solution	PAA laboratories	H15-002
Alexa Fluor 488 Phaloidin	Molecular Probes	A12379
Anti-vinculin antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	V9131
Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine	Molecular Probes	T-2762
Anti-Fibronectin (rabbit)	Sigma-Aldrich	F3648
Streptavidin	Sigma-Aldrich	41469
Anti-Laminin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	L9393
Anti-rabbit IgG-FITC	Sigma-Aldrich	F7512
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924-100ML
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	459844-2.5L