成年斑马鱼视网膜再生研究中使用的一种新型的光损伤范式

摘要

多个光损伤协议已损坏感光细胞，从而诱发成年斑马鱼视网膜的再生反应。此协议描述了一种改进的方法，可以用在着色的动物，并在整个视网膜杆和视锥细胞，损害绝大多数。

摘要

光诱导的视网膜变性（LIRD）是常用的啮齿动物损伤杆和视锥细胞和斑马鱼。在成年斑马鱼，光感受器变性触发穆勒胶质细胞重新进入细胞周期和产生瞬态放大祖​​。这些前体细胞继续增殖，他们迁移到受损区域，他们最终产生新感光。目前，有两个广泛使用LIRD的范例，其中每个感光损失和相应的差异在再生反应在不同程度的结果。随着遗传学和药理学工具可用于测试单个基因在再生过程中的利益的作用，有必要制定一个强大的LIRD范式。这里我们描述一个LIRD协议，导致在杆和锥感光体，其中结合使用的两个以前建立LIRD技术的广泛和一致的损失。此外这个协议可以延长使用色素的动物，从而消除了需要保持白化背景LIRD研究的转基因株系的利息。

引言

光诱导的视网膜变性（LIRD）是常用的啮齿动物损伤杆和视锥细胞和斑马鱼。在成年斑马鱼，光感受器变性触发穆勒胶质细胞重新进入细胞周期和产生瞬态放大祖​​。这些祖细胞继续增殖，因为他们迁移到受损区域，在那里他们最终产生新的光感受器。目前，有两个广泛使用LIRD的范例，其中每个感光损失和相应的差异在再生反应在不同程度的结果。随着遗传学和药理学工具可用于测试单个基因在再生过程中的利益的作用，有必要制定一个强大的LIRD范式。这里我们描述一个LIRD协议，导致在杆和锥感光体，其中结合使用的两个以前建立LIRD技术的广泛和一致的损失。此外这个协议可以延长使用色素的动物，从而消除了需要保持白化背景LIRD研究的转基因株系的利息。

研究方案

在韦恩州立大学医学院动物使用委员会批准，在本协议中所述的所有程序。

1。暗适应

1. 转让〜10成年白化或色素的鱼，从正常的住房制度进入一个黑暗的外壳。如果可用，建成斑马鱼的正常水流通过水箱外壳模块，它允许使用一个黑暗的外壳。 （如果这样的系统不可用，放置鱼缸在一个完全黑暗的外壳，确保通气鱼与氧气）。
2. 保持10天的鱼在黑暗中。当喂养动物或加入新鱼暗箱，确保尽可能快地移动，以避免将鱼暴露在相当长的一段光。

2。紫外线照射

1. 确保紫外光源电源关闭。卸下UV光灯丝从荧光体视显微镜。
   1. 使用倒置直径15厘米的玻璃培养皿（或一些类似的2厘米的高度）作为一个独立的UV长丝。用胶带将培养皿中的实验室工作台上。
   2. 带UV光长丝顶部倒培养皿。这样排列〜2毫米的灯丝的端部悬伸的陪替氏培养皿。
2. 获得的250毫升的玻璃烧杯中。量½底部，侧面，和背面的烧杯中，用铝箔，确保“闪亮”的箔面一侧的内部烧杯。如果毕业烧杯，烧杯带箔覆盖措辞一半，留下清晰的烧杯中露出的一半。
3. 填充在250毫升烧杯中，用100毫升的水从鱼的设施系统。
4. 将250毫升烧杯中4升烧杯中。填充的4升烧杯中的水，直到水位甚至与100毫升水的250毫升烧杯中的线。
5. 添加最多10暗处理动物250毫升烧杯中。量的250毫升烧杯中，用一小片铝陪衬。
6. 将整个烧杯装置，紧邻的UV灯丝。 ，灯丝应接触的外侧的4升烧杯中，并面临着的250毫升烧杯中的暴露部分。确保集中在底部的4升烧杯中的250毫升烧杯中。
7. 后面的4L烧杯中的一个大的，不透明的屏幕的位置，允许暴露的动物，但是，为了防止任何从看到紫外线灯丝的前端的实验室工作人员。警告：确保这个障碍在接通电源前紫外光源。
8. 打开UV电源。将定时器设置为30分钟。放置以确保任何必要的警示标签，不知情的实验室的工作人员不小心把自己暴露于紫外线辐射。
9. 30分钟后，切断紫外线的动力源。取出250毫升烧杯中的鱼。注：如果有多个回合的紫外线的照射是必需的，让电源降温（约20分钟），然后重复曝光的协议。确保替代T他每次曝光系统用新鲜水100毫升水。在4升烧杯中的水并不需要更换。

3。卤素灯光曝光

1. 从250毫升烧杯中的鱼转移到一个1.8升的透明亚克力鱼缸。油箱加满到溢出标记。
2. 卤素灯的光处理区域。获得四个250瓦的卤素灯实用灯，从当地的五金商店。面对两个灯在同一个方向，在中央分开安排29厘米。以类似的方式排列的两个灯。
   1. 将第二组灯，使它们面对所述第一组灯，留下约73厘米之间的两组灯。这将创建一个29×73厘米的矩形光治疗区域。
3. 获得一个小风扇，从当地的五金商店。将风扇两组灯之间的距离相等，外面的光的治疗区域。
4. 将两个装满水的1.8升罐的中心光治疗区域，两组灯之间的距离相等。灯和水箱的外壁上之间的距离应为〜29厘米。注意：即使只处理10鱼在一个1.8升的油箱，使用这样的安排。需要这两个罐，每个罐的水的温度保持在适当的范围之内。
5. 每罐放置增氧机增氧。
6. 每个水箱盖透明压克力盖，留1〜2厘米的缝隙年底最接近风扇。安排，使风扇将空气吹入这个差距。一个温度计放置在罐中的一者或两者。
7. 打开电源灯，风扇和通风装置。保持光治疗4天。鱼不应该被送入光治疗期间，因为这会影响水质和造成更多的压力的动物。
8. 每天监控温度和水位。的温度保持在30-33℃。如果有必要，调整风扇转速和/或坦克和李之间的距离亮灯。
   1. 每罐顶过水系统，通常需要每天。
   2. 始终使用健康的成年斑马鱼（一般为6-9个月的年龄）保持近100％的成活率。然而，如果鱼被发现死在坦克，取出立即更换整个水箱中的水。

4。组织收集

1. 的卤光治疗在发病后48小时去除鱼从治疗区域。
   1. 准备新鲜乙醇甲醛固定液（1份37％的甲醛，9份100％的乙醇）。
   2. 安乐死斑马鱼与麻醉剂过量的2 - 苯氧基乙醇（0.4毫克/升）。
   3. 将安乐死斑马鱼的纸巾。用弯钳Enucleate眼睛。
   4. 将去核的眼睛在固定液和存储O / N在4°C
2. Cryoprotect眼睛。
   1. 在5％蔗糖的1倍PBS洗眼睛，在室温下30分钟，然后更换新鲜的5％蔗糖的1倍PBS 2小时。接下来，洗眼睛，30％的蔗糖1X PBSØ/ N在4°C。在4℃下以1:1的（相等的部分）的组织的冷冻保存液和30％蔗糖的1倍PBSö/ N洗眼睛
3. 嵌入眼睛在100％组织冷冻介质和存储于-80°C东方的眼睛，使的组织cryosectioning的背/腹轴。
4. 组织冰冻切片，在载玻片上。 2小时，在55℃的暖幻灯片商店幻灯片在-80°C或立即执行标准免疫组化。
5. 执行标准切片组织的免疫组化和荧光显微镜图像^40,51。

结果

此前所述的光治疗方案相比，每一个人的LIRD方法。在暗处理成年的白化动物（ 图3-5），个人光疗法造成重大损失棒（ 图3）和锥感光器（ 图4）。然而，无论是单独的治疗方法主要损坏感光体在背侧视网膜一半，留下相对保护的光的治疗方法（ 图3和4）的腹侧视网膜。此外，相比与卤素灯处理，UV光处理损坏的视锥细胞在背视?...

讨论

在这里，我们提供持续的强光曝晒普遍的感光损失和强大的再生反应的结果，结合短的紫外线照射。这个相结合的方法相比与个人LIRD方法，也是最有效的协议，损害双方的两部分的视网膜杆和视锥。重要的是，这种治疗是有效的颜料的动物，以及患白化病的动物。

虽然我们提供的证据表明与个别LIRD方法相比更为广泛和一致的损伤合并协议结果，科学的考虑，应该讨论...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
UV light source	Leica	EL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm)	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS3160152BO
250 ml glass beaker	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS1000250
4 L glass beaker	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS10004L
Aluminum foil	Fisher	01-213-105
250 W halogen lamps	Workforce	265-669
1.8 L clear acrylic tanks	Aquaneering	ZT180T
1.8 L clear acrylic tank lids	Aquaneering	ZT180LCL
Fan	Honeywell	HT-900
Aerator	Tetra	77853-900
Thermometer	Cole-Parmer	YO-08008-58
Bent forceps (5/45)	World Precision Instruments	504155