JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Несколько протоколов свет повреждения были описаны повреждения фоторецепторов и, следовательно, вызвать регенерацию сетчатки в ответ взрослых данио. Этот протокол описывает усовершенствованный способ, который можно использовать в пигментированных животных и который повреждает подавляющее большинство палочек и колбочек фоторецепторов по всей сетчатки.

Аннотация

Светоиндуцированный дегенерации сетчатки (LIRD) обычно используется как у грызунов и рыбок данио к стержню повреждения и конус фоторецепторов. В взрослых данио, вызывает дегенерацию фоторецепторов Müller глиальные клетки, чтобы вновь войти в клеточный цикл и оказывать кратковременное усиливающее предшественников. Эти предшественники продолжают размножаться, как они мигрируют в поврежденную область, где они в конечном счете привести к появлению новых фоторецепторов. В настоящее время существует два широко используемых LIRD парадигмы, каждый из которых приводит к различной степени потери фоторецепторов и соответствующих различий в регенерации ответа. Чем больше генетических и фармакологические средства доступны для проверки роли отдельных интересующих генов в процессе регенерации, существует необходимость в разработке надежной LIRD парадигме. Здесь мы опишем LIRD протокол, который приводит к широко распространенной и последовательной потере и палочек и колбочек, фоторецепторы, в котором мы объединили использование двух ранее установленных LIRD методов. Более того, Этот протокол может быть расширен для использования в пигментированных животных, что устраняет необходимость поддержания трансгенных линий процентов на альбиноса фон для исследования LIRD.

Введение

Светоиндуцированный дегенерации сетчатки (LIRD) обычно используется как у грызунов и рыбок данио к стержню повреждения и конус фоторецепторов. В взрослых данио, вызывает дегенерацию фоторецепторов Müller глиальные клетки, чтобы вновь войти в клеточный цикл и оказывать кратковременное усиливающее предшественников. Эти предшественники продолжают размножаться, как они мигрируют в поврежденную область, где они в конечном счете привести к появлению новых фоторецепторов. В настоящее время существует два широко используемых LIRD парадигмы, каждый из которых приводит к различной степени потери фоторецепторов и соответствующих различий в регенерации ответа. Чем больше генетических и фармакологические средства доступны для проверки роли отдельных интересующих генов в процессе регенерации, существует необходимость в разработке надежной LIRD парадигме. Здесь мы опишем LIRD протокол, который приводит к широко распространенной и последовательной потере и палочек и колбочек, фоторецепторы, в котором мы объединили использование двух ранее установленных LIRD методов. Более того, Этот протокол может быть расширен для использования в пигментированных животных, что устраняет необходимость поддержания трансгенных линий процентов на альбиноса фон для исследования LIRD.

протокол

Все процедуры, описанные в этом протоколе были утверждены Комитетом использования животных в Wayne State University школы медицины.

1. Адаптации к темноте

  1. Передача ~ 10 взрослых белых или пигментированные рыбу от нормальной системы жилищного в темном шкафу. По возможности используйте темные корпуса, который встроен в корпус модуля данио, что позволяет нормальный поток воды через бак. (Если такая система отсутствует, разместить аквариум в совершенно темном корпусе, убедившись, чтобы проветрить рыбы с кислородом).
  2. Держать рыбу в темноте в течение 10 дней. При кормлении животных или добавлении новых рыб в темную коробку, убедитесь, чтобы двигаться как можно быстрее, чтобы не подвергать рыбу длительное света.

2. Ультрафиолетовых лучей

  1. Убедитесь, что питание на источник УФ-выключено. Снимите УФ света с лампами накаливания от люминесцентных стереомикроскоп.
    1. Используйте перевернутый15 см в диаметре стекла чашки Петри (или что-то подобное высотой 2 см) в качестве подставки для УФ нити. Лента чашку Петри на лабораторном столе.
    2. Лента УФ света с лампами накаливания в верхней части перевернутой чашки Петри. Организовать так, что ~ 2 мм от конца нити выступы чашки Петри.
  2. Получение 250-мл химический стакан. Крышка ½ от дна, боковых стенок и задней стакан с алюминиевой фольгой, убедившись, что "блестящий" сторону фольги обращен внутрь стакана. Если стакан закончил, покрытие сформулирован половине стакана фольгой, оставляя ясно половине стакана подвергается.
  3. Наполните 250 мл стакане с 100 мл воды из системы средство рыбы.
  4. Поместите 250 мл стакан в 4 л стакан. Заполните 4 л стакан с водой, пока уровень воды не сравняется с 100 мл воды линию в 250 мл стакан.
  5. Добавить максимум 10 темно-обработанных животных в 250 мл химический стакан. Обложка 250 мл стакан с небольшой кусочек алюминияфольгой.
  6. Поместить все устройство стакан, непосредственно примыкающей к УФ нити. Нить должна касаться внешней стороны 4 л стакан и перед открытой части 250 мл химический стакан. Убедитесь, что в 250-миллилитровый химический стакан находится в центре нижней части 4 л стакан.
  7. Поместите большой, непрозрачный экран за 4L стакан, позволяя для животных подвергаться воздействию, но предотвращая любые лаборатории персонала от видеть кончик УФ нити. ВНИМАНИЕ: Не забудьте этот барьер на месте до включения питания на источник УФ.
  8. Включите УФ источника питания. Установите таймер на 30 мин. Поместите все необходимые предупредительные надписи, чтобы убедиться, что ничего не подозревающих сотрудников лаборатории случайно не подвергать себя УФ-излучения.
  9. Через 30 минут, выключите УФ источника питания. Удалить 250 мл химический стакан с рыбой. Примечание: Если несколько раундов ультрафиолетового облучения требуется, пусть источник питания остыть (~ 20 мин) перед повторением воздействия протокола. Не забудьте заменить тон 100 мл воды со свежей водной системы для каждой экспозиции. Вода в 4 л стакан не нуждается в замене.

3. Галогенные лампы освещенность

  1. Передача рыбы из 250 мл стакан в 1,8 л емкости очищенной рыбы акрил. Залить в бак к переполнению марки.
  2. Настройте свет галогенных ламп области лечения. Получим четыре 250 Вт галогенные лампы утилита от местного хозяйственного магазина. Сталкивается с двумя лампами в том же направлении, организовать 29 см друг от друга по центру. Разместите другие две лампы аналогичным образом.
    1. Поместите второй набор ламп так, что они сталкиваются с первым набором ламп, оставляя ~ 73 см между двумя группами ламп. Это создает прямоугольную форму светолечение площадью 29 х 73 см.
  3. Получить небольшой вентилятор от местного хозяйственного магазина. Ставьте вентилятор на равном расстоянии между двумя группами ламп, недалеко от светлой области лечения.
  4. Поместите два 1,8 л танки полны воды в центреСветлая область лечения, на равном расстоянии между двумя группами ламп. Расстояние между лампами и внешней стенки резервуара должна быть ~ 29 см. Примечание: даже если только 10 рыб лечении в одной бака 1,8 л, используйте эту договоренность. Оба танка, необходимые для поддержания температуры воды каждого бака в пределах соответствующего диапазона.
  5. Наведите кислорода аэратора в каждом баке.
  6. Обложка каждого танка с ясными акриловыми крышками, оставляя ~ 2 см зазор на конце, ближайшем к вентилятору. Расположите вентилятор таким образом, это будет удар воздуха в этот пробел. Место термометр в одном или обоих резервуарах.
  7. Включите питание на фары, вентилятор, и аэраторы. Поддерживать светолечение до 4 дней. Рыбы, не должны подаваться в течение светового лечения, так как это повлияет на качество воды и в результате больше стресса для животных.
  8. Мониторинг температуры и уровня воды на ежедневной основе. Поддерживайте температуру в 30-33 ° C. При необходимости регулировать скорость вентилятора и / или расстояния между танками и ЛиGHTS.
    1. Топ с каждого бака с системой воду по мере необходимости, как правило, ежедневно.
    2. Всегда используйте здоровых взрослых данио (обычно 6-9 месяцев), чтобы сохранить выживаемость приближается к 100%. Тем не менее, если рыба найдена мертвой в баке, немедленно извлеките его и замените воду в весь бак.

4. Коллекция тканей

  1. 48 ч после начала лечения светом галогенных удалить рыб из зоны обработки.
    1. Подготовьте свежий этанольного фиксатором формальдегида (1 часть 37%-ного формальдегида, 9 частей 100% этанол).
    2. Эвтаназии данио с анестетиком передозировки 2-феноксиэтанол (0,4 мг / л).
    3. Передача эвтаназии данио бумажным полотенцем. Выяснять глаз с помощью пинцетов.
    4. Наведите энуклеированными глаза в магазине фиксатор и O / N при 4 ° C.
  2. Cryoprotect глаз.
    1. Промыть глаза в 5% сахарозы 1x PBS в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем заменитьсвежий 5% сахарозы 1x PBS в течение 2 часов. Затем промыть глаза в 30% сахарозе 1x PBS O / N при 4 ° С. Промыть глаза 1:1 (равные части) в среде тканевой замораживание и 30% сахарозы, 1 × PBS O / N при 4 ° С.
  3. Вставить глаза в 100% среде тканевой замораживания и хранить при температуре -80 ° С. Восток глаза так, что cryosectioning ткани выполняется на спинной / вентральной оси.
  4. Cryosection ткани и места на предметных стеклах. Теплый слайды в течение 2 ч при 55 ° С. Магазин слайды при -80 ° С или сразу выполнять стандартные иммуногистохимии.
  5. Выполнять стандартные иммуногистохимии секционного ткани и изображение с флуоресцентной микроскопией 40,51.

Результаты

Описано ранее протокол светолечение сравнивали с каждого отдельного метода LIRD. В темных обработанных взрослых белых животных (рис. 3-5), индивидуальные процедуры света приводило к значительным потерям стержня (рис. 3) и конус (рис. 4) фоторецепторов. Тем не ?...

Обсуждение

Здесь мы показываем, что сочетание короткого ультрафиолетового облучения с постоянным ярким светом воздействие приводит к массовой гибели фоторецепторов и устойчивых мер в ответ регенерации. По сравнению с отдельными методами LIRD, это комбинированный метод также является наиболее эф...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Xixia Ло за отличную рыбу хозяйство и техническую поддержку. Эта работа финансировалась Национальным институтом здоровья гранты R21EY019401 (RT) и P30EY04068 (RT), а стартовый капитал до комнатной температуры, в том числе неограниченный грант от научных исследований до предотвратить слепоту в Wayne State University, кафедра офтальмологии. JT была поддержана Томас К. Rumble стипендий, предоставляемых Wayne State университета Высшая школа.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
UV light sourceLeicaEL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm)Sigma-Aldrich/PyrexCLS3160152BO
250 ml glass beakerSigma-Aldrich/PyrexCLS1000250
4 L glass beakerSigma-Aldrich/PyrexCLS10004L
Aluminum foilFisher01-213-105
250 W halogen lampsWorkforce265-669
1.8 L clear acrylic tanksAquaneeringZT180T
1.8 L clear acrylic tank lidsAquaneeringZT180LCL
FanHoneywellHT-900
AeratorTetra77853-900
ThermometerCole-ParmerYO-08008-58
Bent forceps (5/45)World Precision Instruments504155

Ссылки

  1. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J. Neurosci. 27, 7028-7040 (2007).
  2. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J. Neurosci. 26, 6303-6313 (2006).
  3. Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
  4. Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
  5. Thummel, R., et al. Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration. Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).
  6. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).
  7. Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish. Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).
  8. Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
  9. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).
  10. Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev. Biol. 6, 36 (2006).
  11. Thummel, R., et al. Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration. Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).
  12. Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina. Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).
  13. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. J. Comp. Neurol. 518, 800-814 (2010).
  14. Morris, A. C., Scholz, T. L., Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetic dissection reveals two separate pathways for rod and cone regeneration in the teleost retina. Dev. Neurobiol. 68, 605-619 (2008).
  15. Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Muller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp. Eye Res. 28, 63-69 (1979).
  16. Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).
  17. Bringmann, A., Wiedemann, P. Muller glial cells in retinal disease. Ophthalmologica. 227, 1-19 (2012).
  18. Eisenfeld, A. J., Bunt-Milam, A. H., Sarthy, P. V. Muller cell expression of glial fibrillary acidic protein after genetic and experimental photoreceptor degeneration in the rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 25, 1321-1328 (1984).
  19. Anderson, D. H., Guerin, C. J., Erickson, P. A., Stern, W. H., Fisher, S. K. Morphological recovery in the reattached retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 168-183 (1986).
  20. Bruce, A. E., Oates, A. C., Prince, V. E., Ho, R. K. Additional hox clusters in the zebrafish: divergent expression patterns belie equivalent activities of duplicate hoxB5 genes. Evol. Dev. 3, 127-144 (2001).
  21. Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
  22. Lewis, G. P., Fisher, S. K. Muller cell outgrowth after retinal detachment: association with cone photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 1542-1545 (2000).
  23. Fischer, A. J., Bongini, R. Turning Muller glia into neural progenitors in the retina. Mol. Neurobiol. 42, 199-209 (2010).
  24. Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends Mol. Med. 16, 193-202 (2010).
  25. Close, J. L., Liu, J., Gumuscu, B., Reh, T. A. Epidermal growth factor receptor expression regulates proliferation in the postnatal rat retina. Glia. 54, 94-104 (2006).
  26. Das, A. V., et al. Neural stem cell properties of Muller glia in the mammalian retina: regulation by Notch and Wnt signaling. Dev. Biol. 299, 283-302 (2006).
  27. Ikeda, T., Puro, D. G. Regulation of retinal glial cell proliferation by antiproliferative molecules. Exp. Eye Res. 60, 435-443 (1995).
  28. Liu, B., et al. Wnt signaling promotes muller cell proliferation and survival after injury. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54, 444-453 (2013).
  29. Osakada, F., et al. Wnt signaling promotes regeneration in the retina of adult mammals. J. Neurosci. 27, 4210-4219 (2007).
  30. Wan, J., et al. Preferential regeneration of photoreceptor from Muller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. 48, 223-234 (2008).
  31. Wan, J., Zheng, H., Xiao, H. L., She, Z. J., Zhou, G. M. Sonic hedgehog promotes stem-cell potential of Muller glia in the mammalian retina. Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 347-354 (2007).
  32. Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Muller glial cells. J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (1002).
  33. Chang, G. Q., Hao, Y., Wong, F. Apoptosis: final common pathway of photoreceptor death in rd, rds, and rhodopsin mutant mice. Neuron. 11, 595-605 (1993).
  34. Marc, R. E., et al. Extreme retinal remodeling triggered by light damage: implications for age related macular degeneration. Mol. Vis. 14, 782-806 (2008).
  35. Portera-Cailliau, C., Sung, C. H., Nathans, J., Adler, R. Apoptotic photoreceptor cell death in mouse models of retinitis pigmentosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 974-978 (1994).
  36. Noell, W. K., Walker, V. S., Kang, B. S., Berman, S. Retinal damage by light in rats. Invest. Ophthalmol. 5, 450-473 (1966).
  37. Wenzel, A., Grimm, C., Samardzija, M., Reme, C. E. Molecular mechanisms of light-induced photoreceptor apoptosis and neuroprotection for retinal degeneration. Prog. Retin. Eye Res. 24, 275-306 (2005).
  38. Cicerone, C. M. Cones survive rods in the light-damaged eye of the albino rat. Science. 194, 1183-1185 (1976).
  39. La Vail, M. M. Survival of some photoreceptor cells in albino rats following long-term exposure to continuous light. Invest. Ophthalmol. 15, 64-70 (1976).
  40. Thomas, J. L., Nelson, C. M., Luo, X., Hyde, D. R., Thummel, R. Characterization of multiple light damage paradigms reveals regional differences in photoreceptor loss. Exp. Eye Res. 97, 105-116 (2012).
  41. Qin, Z., et al. FGF signaling regulates rod photoreceptor cell maintenance and regeneration in zebrafish. Exp. Eye Res. 93, 726-734 (2011).
  42. Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).
  43. Morris, A. C., Schroeter, E. H., Bilotta, J., Wong, R. O., Fadool, J. M. Cone survival despite rod degeneration in XOPS-mCFP transgenic zebrafish. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 4762-4771 (2005).
  44. Nelson, C. M., Hyde, D. R. Muller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
  45. Powell, C., Elsaeidi, F., Goldman, D. Injury-dependent Muller glia and ganglion cell reprogramming during tissue regeneration requires Apobec2a and Apobec2b. J. Neurosci. 32, 1096-1109 (2012).
  46. Ramachandran, R., Reifler, A., Wan, J., Goldman, D. Application of Cre-loxP recombination for lineage tracing of adult zebrafish retinal stem cells. Methods Mol. Biol. 884, 129-140 (2012).
  47. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/Dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15858-15863 (2011).
  48. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Insm1a-mediated gene repression is essential for the formation and differentiation of Muller glia-derived progenitors in the injured retina. Nat. Cell Biol. 14, 1013-1023 (2012).
  49. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev. Cell. 22, 334-347 (2012).
  50. Morris, A. C., Forbes-Osborne, M. A., Pillai, L. S., Fadool, J. M. Microarray analysis of XOPS-mCFP zebrafish retina identifies genes associated with rod photoreceptor degeneration and regeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 2255-2266 (2011).
  51. Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J. Vis. Exp. (58), e3603 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Neuroscience80Retina

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены