A Novel leichte Schäden Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafisch

Zusammenfassung

Mehrere leichte Schäden Protokolle, um Schäden Photorezeptoren beschrieben worden und folglich induzieren eine Netzhautregeneration Reaktion in erwachsenen Zebrafisch. Dieses Protokoll beschreibt ein verbessertes Verfahren, das in pigmentierten Tieren verwendet werden kann und dass Schäden, die überwiegende Mehrheit der lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen über die gesamte Netzhaut.

Zusammenfassung

Licht-induzierte Degeneration der Netzhaut (LIRD) wird häufig in beiden Nager und Zebrafisch, um Schäden lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen verwendet. Bei erwachsenen Zebrafisch, löst Photorezeptordegeneration Müller Gliazellen um wieder in den Zellzyklus und erzeugen transiente verstärkenden Vorläuferzellen. Diese Vorläuferzellen weiter zu vermehren, wie sie wandern auf den beschädigten Bereich, wo sie letztlich Anlass zu neuen Photorezeptoren. Derzeit gibt es zwei weit verbreitete LIRD Paradigmen, die jeweils Ergebnisse in verschiedenen Graden der Photorezeptor Verlust und entsprechende Unterschiede in der Regeneration Antwort. Als weitere genetische und pharmakologische Werkzeuge zur Verfügung, die Rolle einzelner Gene von Interesse während der Regeneration zu testen sind, besteht ein Bedarf an einer robusten LIRD Paradigma zu entwickeln. Hier beschreiben wir eine LIRD Protokoll, dass die Ergebnisse weit verbreitet und konsequente Verlust beider lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen, in denen wir die Verwendung von zwei vorher festgelegten LIRD Techniken kombiniert haben. FernerKann dieses Protokoll für den Einsatz in pigmentierten Tieren, die die Notwendigkeit einer transgenen Linien von Interesse auf der Albino Hintergrund für LIRD Untersuchungen aufrechtzuerhalten beseitigt verlängert werden.

Einleitung

Licht-induzierte Degeneration der Netzhaut (LIRD) wird häufig in beiden Nager und Zebrafisch, um Schäden lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen verwendet. Bei erwachsenen Zebrafisch, löst Photorezeptordegeneration Müller Gliazellen um wieder in den Zellzyklus und erzeugen transiente verstärkenden Vorläuferzellen. Diese Vorläuferzellen weiter zu vermehren, wie sie wandern auf den beschädigten Bereich, wo sie letztlich Anlass zu neuen Photorezeptoren. Derzeit gibt es zwei weit verbreitete LIRD Paradigmen, die jeweils Ergebnisse in verschiedenen Graden der Photorezeptor Verlust und entsprechende Unterschiede in der Regeneration Antwort. Als weitere genetische und pharmakologische Werkzeuge zur Verfügung, die Rolle einzelner Gene von Interesse während der Regeneration zu testen sind, besteht ein Bedarf an einer robusten LIRD Paradigma zu entwickeln. Hier beschreiben wir eine LIRD Protokoll, dass die Ergebnisse weit verbreitet und konsequente Verlust beider lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen, in denen wir die Verwendung von zwei vorher festgelegten LIRD Techniken kombiniert haben. FernerKann dieses Protokoll für den Einsatz in pigmentierten Tieren, die die Notwendigkeit einer transgenen Linien von Interesse auf der Albino Hintergrund für LIRD Untersuchungen aufrechtzuerhalten beseitigt verlängert werden.

Protokoll

Alle Vorgänge in diesem Protokoll beschrieben wurden durch die Verwendung von Tieren Ausschuss an der Wayne State University School of Medicine genehmigt.

1. Dunkle Anpassung

1. Übertragen ~ 10 erwachsene Albino oder pigmentierte Fisch aus dem normalen Gehäuse-System in einen dunklen Schrank. Wenn vorhanden, mit einem dunklen Gehäuse, in das Gehäuse Zebrafisch-Modul, das für die normale Wassermenge durch den Tank ermöglicht gebaut wird. (Wenn ein solches System nicht verfügbar ist, legen Sie das Aquarium in einem völlig dunklen Gehäuse, achten Sie darauf, die Fische mit Sauerstoff belüften).
2. Halten Sie den Fisch in der Dunkelheit für 10 Tage. Bei der Fütterung der Tiere oder das Hinzufügen neuer Fisch an den dunklen Kasten, vergewissern Sie sich so schnell wie möglich zu bewegen, um zu vermeiden, dass die Fische mit einem langen Zeitraum des Lichts.

2. UV-Licht Exposition

1. Sicherstellen, dass die Stromversorgung der UV-Quelle ist AUS. Entfernen Sie das UV-Licht fluoreszierenden Filament aus Stereomikroskop.
   1. Verwenden Sie einen umgekehrten15 cm Durchmesser Glas Petrischale (oder etwas von einem ähnlichen 2 cm Höhe) als Ständer für die UV-Filament. Kleben Sie die Petrischale auf dem Labortisch.
   2. Kleben Sie die UV-Licht Filament des umgekehrten Petrischale oben. So anzuordnen, dass ca. 2 mm von dem Ende des Filaments Überhänge die Petrischale.
2. Besorgen Sie sich einen 250 ml Becherglas. Titelbild ½ der Boden, Seiten und Rückseite des Bechers mit Alufolie, so dass das "glänzende" Seite der Folie steht das Innere des Bechers. Wenn der Becher ist abgestuft, decken Sie den Wortlaut Hälfte des Bechers mit Folie, so dass die klare Hälfte des Bechers ausgesetzt.
3. Füllen Sie den 250-ml-Becherglas mit 100 ml Wasser aus dem Fisch Facility Systeme.
4. Legen Sie die 250 ml Becherglas in einem 4 L Becherglas. Füllen Sie den 4 L Becherglas mit Wasser, bis der Wasserstand sogar mit dem 100 ml Wasser-Linie in der 250 ml-Becher ist.
5. In maximal 10 dunkel-behandelten Tieren der 250-ml-Becherglas. Bedecken Sie den 250-ml-Becherglas mit einem kleinen Stück aus Aluminiumvereiteln.
6. Platzieren Sie den ganzen Becher Apparat unmittelbar neben dem UV-Filament. Der Faden soll an die Außenseite des 4 L-Becherglas gegeben und mit Blick auf den freiliegenden Teil der 250-ml-Becherglas. Stellen Sie sicher, dass die 250-ml-Becherglas in den Boden des 4 L Becherglas zentriert ist.
7. Positionieren Sie einen großen, undurchsichtigen Schirm hinter dem 4L Becherglas, so dass für die Tiere ausgesetzt werden, sondern die Verhinderung jeglicher Laborpersonal vom Sehen der Spitze des UV Filament. WARNUNG: Stellen Sie sicher, dass diese Barriere ist, bevor Sie das Gerät einschalten, um die UV-Quelle.
8. Schalten Sie die UV-Stromquelle. Set Timer für 30 min. Platzieren, was notwendig Warnschilder um sicherzustellen, dass ahnungslose Laborpersonal nicht versehentlich setzen sich gegen UV-Strahlung.
9. Nach 30 min, Absperren der UV Stromquelle. Nehmen Sie die 250 ml-Becher mit dem Fisch. Hinweis: Wenn mehrere Runden von UV-Belichtung, die erforderlich sind, lassen Sie die Stromquelle abkühlen (~ 20 min) vor der Wiederholung der Exposition Protokoll. Achten Sie darauf, t ersetzener 100 ml Wasser mit frischem Wasser-System für jede Aufnahme. Das Wasser im 4 L Becherglas nicht ersetzt werden müssen.

3. Halogen Lamp Light Exposure

1. Übertragen Sie die Fische aus 250 ml Becherglas in einem 1,8 L klaren Acryl-Aquarium. Füllen Sie den Tank bis zum Überlauf Marke.
2. Richten Sie das Licht einer Halogenlampe Behandlungsbereich. Erhalten vier 250 W Halogen-Lampen-Dienstprogramm von einem lokalen Baumarkt. Mit Blick auf zwei Lampen in der gleichen Richtung, ordnen 29 cm auseinander auf Mitte. Ordnen Sie die anderen zwei Lampen in einer ähnlichen Weise.
   1. Platzieren des zweiten Satzes von Lampen, so dass sie gegenüber dem ersten Satz von Lampen, wobei ~ 73 cm zwischen den beiden Sätzen von Lampen. Dies erzeugt eine Rechteck-Form-Licht Behandlung Fläche von 29 x 73 cm.
3. Besorgen Sie sich einen kleinen Ventilator von einem lokalen Baumarkt. Platzieren Sie den Lüfter genau zwischen den beiden Gruppen von Lampen, etwas außerhalb des Licht-Behandlung Bereich.
4. Legen Sie zwei 1,8 L Behälter voll Wasser in der Mitte desLicht Behandlungsbereich, genau zwischen den beiden Sätzen von Lampen. Der Abstand zwischen den Lampen und der Außenwand des Behälters sollte ~ 29 cm betragen. Hinweis: Selbst wenn nur die Behandlung von 10 Fische in einem 1,8 l-Tank, verwenden diese Anordnung. Beide Behälter sind erforderlich, um die Temperatur des Wassers von jedem Behälter in dem geeigneten Bereich zu halten.
5. Legen Sie ein Sauerstoff-Luftsprudler in jedem Tank.
6. Cover jede Tank mit klarem Acryl Deckel, so dass ein ~ 2 cm Lücke am Ende in der Nähe des Lüfters. Ordnen Sie den Lüfter so, dass es Luft in diesen Spalt blasen wird. Setzen Sie ein Thermometer in einem oder beiden der Tanks.
7. Schalten Sie das Gerät auf die Lichter, Lüfter-und Belüfter. Pflegen Licht-Behandlung für bis zu 4 Tage. Der Fisch sollte nicht während der Licht-Behandlung zugeführt werden, da dies die Wasserqualität und führen zu mehr Stress für die Tiere zu beeinträchtigen.
8. Überwachen Temperatur und Wasserstand auf einer täglichen Basis. Pflegen Sie die Temperatur bei 30-33 ° C. Wenn nötig, stellen Sie die Lüftergeschwindigkeit und / oder den Abstand zwischen den Tanks und der lights.
   1. Krönung jeder Tank mit Wasser-System nach Bedarf, in der Regel täglich.
   2. Verwenden Sie immer gesunden erwachsenen Zebrafisch (in der Regel 6-9 Monate alt), um eine Überlebensrate von nahezu 100% zu halten. Allerdings, wenn ein Fisch tot im Becken gefunden, entfernen Sie es sofort, und ersetzen Sie das Wasser im gesamten Tank.

4. Gewebeentnahme

1. 48 Stunden nach Beginn der Behandlung zu entfernen Halogenlicht die Fische aus dem Behandlungsbereich.
   1. Bereiten Sie frischen ethanolischen Formaldehyd Fixativ (1 Teil 37% Formaldehyd, 9 Teilen 100% Ethanol).
   2. Euthanize Zebrafisch mit einem Anästhetikum Überdosierung von 2-Phenoxyethanol (0,4 mg / L).
   3. Übertragen Sie die eingeschläfert Zebrafisch zu einem Papiertuch. Enucleate das Auge mit einer gebogenen Pinzette.
   4. Zeigen entkernte Augen in Fixiermittel und Speicher O / N bei 4 ° C.
2. Cryoprotect die Augen.
   1. Waschen der Augen in 5% Saccharose 1x PBS für 30 min bei Raumtemperatur gerührt, dann mit ersetzenfrische 5% Saccharose 1x PBS für 2 Stunden. Anschließend waschen Sie die Augen in 30% Saccharose 1x PBS O / N bei 4 ° C. Waschen der Augen in einem 1:1 (gleiche Teile) des Gewebes Einfriermedium und 30% Saccharose 1x PBS O / N bei 4 ° C.
3. Integrieren Sie die Augen in 100% Gewebe Einfrieren Medium und bei -80 ° C Orient die Augen, so daß Kryoschneiden des Gewebes auf der dorsal / ventral Achse.
4. Kryoschnitt das Gewebe und auf Glasplatten. Warm Folien für 2 Stunden bei 55 ° C. Shop Objektträger bei -80 ° C oder sofort ausführen Standard Immunhistochemie.
5. Führen Standard Immunhistochemie auf geschnittene Gewebe und Bild mit Fluoreszenzmikroskopie ^40,51.

Ergebnisse

Die bisher beschriebenen Licht-Behandlung Protokoll wurde zu jedem einzelnen Verfahren LIRD verglichen. In dunkel-behandelten erwachsenen Albinos (Abbildungen 3-5), führte die einzelnen Licht-Behandlungen in signifikanten Verlust der Stange (Abbildung 3) und Kegel (Abbildung 4) Photorezeptoren. Doch sowohl die einzelnen Behandlungen in erster Linie Photorezeptoren in der dorsalen Hälfte der Netzhaut beschädigt, so dass der ventralen Retina relativ von den Li...

Diskussion

Hier zeigen wir, dass die Kombination eine kurze UV-Bestrahlung mit einer kontinuierlichen helles Licht Exposition Ergebnisse in weit verbreiteten Photorezeptor Verlust und eine robuste Regeneration Antwort. Verglichen mit den einzelnen LIRD Methoden ist dies kombiniert Verfahren auch die effektivste Protokoll sowohl Stäbchen und Zapfen in beiden Hälften der Netzhaut beschädigen. Wichtig ist, dass diese Behandlung wirksam bei pigmentierten Tieren sowie Albinos.

Obwohl wir den Bew...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
UV light source	Leica	EL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm)	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS3160152BO
250 ml glass beaker	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS1000250
4 L glass beaker	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS10004L
Aluminum foil	Fisher	01-213-105
250 W halogen lamps	Workforce	265-669
1.8 L clear acrylic tanks	Aquaneering	ZT180T
1.8 L clear acrylic tank lids	Aquaneering	ZT180LCL
Fan	Honeywell	HT-900
Aerator	Tetra	77853-900
Thermometer	Cole-Parmer	YO-08008-58
Bent forceps (5/45)	World Precision Instruments	504155