A Novel lumière paradigme de dommages pour utilisation dans les études de régénération rétinienne chez le poisson zèbre adulte

Résumé

Protocoles de légers dégâts multiples ont été décrits pour les photorécepteurs des dommages et par conséquent induire une réponse de régénération rétinienne chez le poisson zèbre adulte. Ce protocole décrit une méthode améliorée qui peut être utilisé chez les animaux pigmentés et qui endommage la grande majorité de la tige et des cônes photorécepteurs dans la rétine entière.

Résumé

Dégénérescence de la rétine induite par la lumière (LIRD) est couramment utilisé chez les rongeurs et poissons zèbres à la tige des dommages et des cônes photorécepteurs. Chez le poisson zèbre adulte, photorécepteur dégénérescence déclenche les cellules gliales de Müller à réintégrer le cycle cellulaire et de produire des progéniteurs transitoire-amplification. Ces ancêtres continuent à proliférer comme ils migrent vers la zone endommagée, où ils ont finalement donner naissance à de nouveaux photorécepteurs. Actuellement, il existe deux paradigmes LIRD largement utilisés, dont chacune entraîne degrés de perte des photorécepteurs et des différences correspondantes variant dans la réponse de régénération. En plus des outils génétiques et pharmacologiques sont disponibles pour tester le rôle des gènes individuels d'intérêt lors de la régénération, il est nécessaire de développer un paradigme LIRD robuste. Nous décrivons ici un protocole LIRD qui entraîne une perte généralisée et cohérente de deux photorécepteurs bâtonnets et des cônes dans lesquels nous avons combiné l'utilisation de deux techniques LIRD précédemment établies. Par ailleursCe protocole peut être étendu pour une utilisation chez les animaux pigmentés, ce qui élimine la nécessité de maintenir des lignées transgéniques d'intérêt sur le fond albinos pour les études LIRD.

Introduction

Dégénérescence de la rétine induite par la lumière (LIRD) est couramment utilisé chez les rongeurs et poissons zèbres à la tige des dommages et des cônes photorécepteurs. Chez le poisson zèbre adulte, photorécepteur dégénérescence déclenche les cellules gliales de Müller à réintégrer le cycle cellulaire et de produire des progéniteurs transitoire-amplification. Ces ancêtres continuent à proliférer comme ils migrent vers la zone endommagée, où ils ont finalement donner naissance à de nouveaux photorécepteurs. Actuellement, il existe deux paradigmes LIRD largement utilisés, dont chacune entraîne degrés de perte des photorécepteurs et des différences correspondantes variant dans la réponse de régénération. En plus des outils génétiques et pharmacologiques sont disponibles pour tester le rôle des gènes individuels d'intérêt lors de la régénération, il est nécessaire de développer un paradigme LIRD robuste. Nous décrivons ici un protocole LIRD qui entraîne une perte généralisée et cohérente de deux photorécepteurs bâtonnets et des cônes dans lesquels nous avons combiné l'utilisation de deux techniques LIRD précédemment établies. Par ailleursCe protocole peut être étendu pour une utilisation chez les animaux pigmentés, ce qui élimine la nécessité de maintenir des lignées transgéniques d'intérêt sur ​​le fond albinos pour les études LIRD.

Protocole

Toutes les procédures décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le comité de l'utilisation des animaux à la Wayne University School of Medicine Etat.

1. Adaptation à l'obscurité

1. Transfert ~ 10 poissons adultes albinos ou pigmenté à partir du système de logement normale dans une enceinte sombre. Si possible, utilisez un boîtier noir qui est intégré dans le module de logement poisson zèbre, ce qui permet l'écoulement normal de l'eau dans le réservoir. (Si un tel système n'est pas disponible, placez le réservoir de poissons dans un boîtier entièrement noir, en veillant à aérer le poisson avec de l'oxygène).
2. Gardez le poisson dans l'obscurité pendant 10 jours. Lors de l'alimentation des animaux ou en ajoutant de nouveaux poissons à la boîte sombre, assurez-vous de passer le plus rapidement possible pour éviter d'exposer le poisson à une longue période de lumière.

2. UV exposition à la lumière

1. Assurez-vous que la puissance de la source UV est éteinte. Retirez le filament de lumière UV stéréoscopique fluorescent.
   1. Utiliser un inversé15 cm de diamètre en verre de Pétri (ou quelque chose de semblable cm hauteur 2) comme un support pour le filament UV. Tape le boîte de Pétri à la paillasse.
   2. Tape le filament de lumière UV en haut de la boîte de Petri inversée. Arrangement de sorte que ~ 2 mm de l'extrémité des saillies de filament de la boîte de Pétri.
2. Obtenir un bécher en verre de 250. Couvrir la moitié du bas, sur les côtés et l'arrière du bécher avec du papier d'aluminium, en s'assurant que le côté "brillant" de la feuille tournée vers l'intérieur du gobelet. Si le récipient est gradué, couvrir la moitié rédigé du bécher d'une feuille, laissant la moitié claire du bécher exposée.
3. Remplir le bécher de 250 ml avec 100 ml d'eau du système d'installation de poisson.
4. Placer le bécher de 250 ml dans un bécher 4. Remplissez le 4 L bécher avec de l'eau jusqu'à ce que le niveau de l'eau est encore à la ligne d'eau de 100 ml dans le bécher de 250 ml.
5. Ajouter un maximum de 10 animaux sombre traités au bécher de 250 ml. Couvrir le bécher de 250 ml avec un petit morceau d'aluminiumdéjouer.
6. Placer l'ensemble de l'appareil de gobelet à proximité immédiate du filament UV. Le filament doit être en contact avec l'extérieur du récipient 4 L et faisant face à la partie exposée du bécher de 250 ml. Assurez-vous que le bécher de 250 ml est centré dans le bas de la 4 L bécher.
7. Placez un grand écran opaque derrière le bécher 4L, ce qui permet aux animaux d'être exposés, mais empêchant tout le personnel de laboratoire de voir le bout du filament UV. ATTENTION: assurez-vous que cette barrière est en place avant la mise sous tension de la source UV.
8. Allumez la source d'alimentation UV. Régler la minuterie pour 30 min. Lieu que ce soit les étiquettes d'avertissement nécessaires pour s'assurer que le personnel de laboratoire sans méfiance ne pas accidentellement s'exposer au rayonnement UV.
9. Après 30 minutes, éteindre la source d'alimentation UV. Retirer le bécher de 250 ml avec le poisson. Remarque: Si plusieurs tours de l'exposition aux UV sont nécessaires, laisser la source d'alimentation refroidir (~ 20 min) avant de répéter le protocole d'exposition. Veillez à remplacer til 100 ml d'eau avec de l'eau fraîche du système pour chaque exposition. L'eau dans le bécher 4 L n'a pas besoin d'être remplacé.

3. Lampe halogène exposition à la lumière

1. Transférer le poisson de 250 ml bécher dans un L aquarium en acrylique transparent 1.8. Remplir le réservoir jusqu'à la marque de débordement.
2. Mettre en place la zone de traitement de la lumière d'une lampe halogène. Obtenir quatre lampes utilitaires halogène de 250 W à partir d'une quincaillerie locale. Face à deux lampes dans la même direction, organiser 29 cm de distance de centre à centre. Disposer les deux autres lampes de la même façon.
   1. Placer le second ensemble de lampes de sorte qu'ils font face à la première série de lampes, en laissant ~ 73 cm entre les deux séries de lampes. Cela crée une zone de traitement par la lumière en forme de rectangle de 29 x 73 cm.
3. Procurez-vous un petit ventilateur à partir d'une quincaillerie locale. Placez le ventilateur à égale distance entre les deux ensembles de lampes, juste à l'extérieur de la zone de traitement par la lumière.
4. Placez deux 1.8 L réservoirs remplis d'eau dans le centre de lala zone de traitement à la lumière, à égale distance entre les deux jeux de lampes. La distance entre les lampes et la paroi extérieure de la cuve doit être ~ 29 cm. Remarque: même si seulement traiter 10 poissons dans un réservoir de 1,8 L, utiliser cet arrangement. Les deux réservoirs sont nécessaires pour maintenir la température de l'eau de chaque réservoir dans la plage appropriée.
5. Placer un aérateur de l'oxygène dans chaque réservoir.
6. Couvrir chaque réservoir avec des couvercles acryliques claires, laissant un écart de ~ 2 cm à l'extrémité la plus proche du ventilateur. Disposer le ventilateur afin qu'il souffler de l'air dans cet espace. Placer un thermomètre dans l'une ou les deux des réservoirs.
7. Tournez sur la puissance de la lumière, des ventilateurs et aérateurs. Maintenir traitement par la lumière pour un maximum de 4 jours. Le poisson ne doit pas être alimenté pendant le traitement par la lumière, car cela aura une incidence sur la qualité de l'eau et se traduisent par plus de stress pour les animaux.
8. Surveiller le niveau de la température et de l'eau sur une base quotidienne. Maintenir la température à 30-33 ° C. Si nécessaire, ajuster la vitesse du ventilateur et / ou la distance entre les réservoirs et la lidro.
   1. Couronner chaque réservoir avec de l'eau du système en fonction des besoins, habituellement tous les jours.
   2. Toujours utiliser le poisson zèbre adulte en bonne santé (en général 6-9 mois d'âge) afin de maintenir un taux de survie de près de 100%. Toutefois, si un poisson est retrouvé mort dans le réservoir, retirez-le immédiatement et remplacez l'eau dans l'ensemble du réservoir.

4. Collection de tissus

1. 48 h après le début du traitement par la lumière d'halogène retirer le poisson de la zone de traitement.
   1. Préparer fixateur de formaldéhyde éthanol frais (1 part 37% de formaldéhyde, 9 parties d'éthanol à 100%).
   2. Euthanasier poisson zèbre avec une surdose d'anesthésique de 2-phénoxyéthanol (0,4 mg / L).
   3. Transférer le poisson zèbre euthanasiés à une serviette en papier. Énucléer l'œil en utilisant des pinces courbes.
   4. Placez les yeux énucléés dans un fixateur et un magasin O / N à 4 ° C.
2. Cryoprotect les yeux.
   1. Laver les yeux à 5% de saccharose 1x PBS pendant 30 min à température ambiante, puis remplacez-le parfrais 5% de saccharose 1x PBS pendant 2 heures. Ensuite, laver les yeux à 30% de saccharose 1x PBS O / N à 4 ° C. Laver les yeux dans un mélange 1:1 (parties égales) de milieu de congélation de tissu et de 30% de saccharose PBS 1x O / N à 4 ° C.
3. Intégrer les yeux dans le milieu de congélation de tissu 100% et conserver à -80 ° C. Orienter les yeux pour que cryosectioning du tissu est réalisé sur l'axe dorsal / ventral.
4. Cryosection le tissu et le placer sur des lames de verre. Diapositives chaudes pendant 2 heures à 55 ° C. Stocker les lames à -80 ° C ou d'effectuer immédiatement immunohistochimie standard.
5. Effectuer standard d'immunohistochimie sur les tissus sectionnés et l'image par microscopie fluorescente ^40,51.

Résultats

Le protocole de traitement de la lumière décrit ci-dessus a été comparée à chaque méthode individuelle de LIRD. Chez les animaux albinos adultes dark-traitées (figures 3-5), les traitements de lumière individuelles a entraîné une perte importante de la tige (Figure 3) et le cône (Figure 4) photorécepteurs. Cependant, les deux traitements individuels endommagés principalement photorécepteurs dans la moitié postérieure de la rétine, en laissant ...

Discussion

Ici, nous montrons que la combinaison d'une exposition aux UV court avec une lumière continuelles résultats d'exposition à une perte des photorécepteurs généralisée et une réponse de régénération robuste. En comparaison avec les méthodes de LIRD individuels, cette méthode combinée est aussi le protocole le plus efficace pour endommager les bâtonnets et les cônes dans les deux moitiés de la rétine. Surtout, ce traitement est efficace chez les animaux pigmentés ainsi que les animaux albinos....

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
UV light source	Leica	EL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm)	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS3160152BO
250 ml glass beaker	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS1000250
4 L glass beaker	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS10004L
Aluminum foil	Fisher	01-213-105
250 W halogen lamps	Workforce	265-669
1.8 L clear acrylic tanks	Aquaneering	ZT180T
1.8 L clear acrylic tank lids	Aquaneering	ZT180LCL
Fan	Honeywell	HT-900
Aerator	Tetra	77853-900
Thermometer	Cole-Parmer	YO-08008-58
Bent forceps (5/45)	World Precision Instruments	504155