A Light Novel danos Paradigma para uso em estudos de regeneração da retina em Zebrafish Adulto

Resumo

Vários protocolos de danos provocados pela luz têm sido descritas para fotorreceptores danos e, consequentemente, induzir uma resposta de regeneração da retina adulta em peixes-zebra. Este protocolo descreve um método melhorado, que pode ser utilizada em animais e pigmentados que danifica a grande maioria dos fotorreceptores cone e da haste ao longo de toda a retina.

Resumo

Degeneração da retina induzida pela luz (LIRD) é comumente usado em roedores e peixe-zebra para haste danos e cones fotorreceptores. No peixe-zebra adulto, degeneração de fotorreceptores provoca células gliais de Müller para re-entrar no ciclo celular e produzir progenitores transitória-amplificação. Estes progenitores continuam a proliferar como eles migram para a área danificada, onde, finalmente, dar origem a novos fotorreceptores. Actualmente, existem dois paradigmas LIRD amplamente utilizados, cada um dos quais resulta em graus variáveis ​​de perda de fotorreceptores e as diferenças correspondentes na resposta regenerativa. Como ferramentas mais genéticos e farmacológicos estão disponíveis para testar o papel dos genes individuais de interesse durante a regeneração, existe uma necessidade de desenvolver um paradigma LIRD robusto. Aqui, nós descrevemos um protocolo LIRD que resulta em perda generalizada e consistente de fotorreceptores cone e da haste na qual se combinaram o uso de duas técnicas LIRD previamente estabelecidos. Além disso, Este protocolo pode ser estendido para o uso em animais pigmentadas, o que elimina a necessidade de manter as linhagens transgênicas de interesse no fundo albino para estudos LIRD.

Introdução

Degeneração da retina induzida pela luz (LIRD) é comumente usado em roedores e peixe-zebra para haste danos e cones fotorreceptores. No peixe-zebra adulto, degeneração de fotorreceptores provoca células gliais de Müller para re-entrar no ciclo celular e produzir progenitores transitória-amplificação. Estes progenitores continuam a proliferar como eles migram para a área danificada, onde, finalmente, dar origem a novos fotorreceptores. Actualmente, existem dois paradigmas LIRD amplamente utilizados, cada um dos quais resulta em graus variáveis ​​de perda de fotorreceptores e as diferenças correspondentes na resposta regenerativa. Como ferramentas mais genéticos e farmacológicos estão disponíveis para testar o papel dos genes individuais de interesse durante a regeneração, existe uma necessidade de desenvolver um paradigma LIRD robusto. Aqui, nós descrevemos um protocolo LIRD que resulta em perda generalizada e consistente de fotorreceptores cone e da haste na qual se combinaram o uso de duas técnicas LIRD previamente estabelecidos. Além disso, Este protocolo pode ser estendido para o uso em animais pigmentadas, o que elimina a necessidade de manter as linhagens transgênicas de interesse no fundo albino para estudos LIRD.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foi aprovado pelo comitê de uso de animais na Wayne State University School of Medicine.

1. Adaptação ao escuro

1. Transferência de ~ 10 adulto albino ou pigmentada peixes do sistema de habitação normal em um recinto escuro. Se possível, use uma caixa escura que está embutido no módulo habitacional peixe-zebra, que permite o fluxo normal da água através do tanque. (Se esse sistema não está disponível, coloque o tanque de peixes em um compartimento completamente escuro, certificando-se de arejar o peixe com oxigênio).
2. Manter o peixe no escuro durante 10 dias. Quando a alimentação dos animais, ou adicionando novos peixes para a caixa escura, certifique-se para mover tão rapidamente quanto possível para evitar expor o peixe a um longo período de luz.

2. Exposição à luz UV

1. Certifique-se que a alimentação da fonte UV é OFF. Remover o filamento de luz UV a partir de estereomicroscópio fluorescente.
   1. Use uma invertida15 centímetros de diâmetro de vidro placa de Petri (ou algo semelhante a dois centímetros de altura) como um suporte para o filamento UV. Tape o prato de Petri para a bancada do laboratório.
   2. Tape o filamento de luz UV para o topo da placa de Petri invertida. Dispor de modo que ~ 2 mm na extremidade das saliências de incandescência a placa de Petri.
2. Obter uma proveta de vidro de 250 ml. Cubra ½ do fundo, nas laterais e parte de trás do copo com uma folha de alumínio, tornando-se o lado "brilhante" da folha voltada para o interior do copo. Se o recipiente é formado, cobrir a metade teor da proveta com a folha, deixando a metade transparente do copo exposta.
3. Encher o copo de 250 ml com 100 ml de água a partir do sistema de instalação de peixe.
4. Colocar o copo de 250 ml numa proveta de 4 litros. Encher a 4 L copo com água até o nível de água é, mesmo com a linha de 100 ml de água no copo de 250 ml.
5. Adicionar um máximo de 10 animais tratados com escuro à proveta de 250 ml. Cobrir a proveta de 250 ml com um pedaço pequeno de alumíniofrustrar.
6. Colocar todo o aparelho proveta imediatamente adjacente ao filamento de UV. O filamento deve estar a tocar o exterior do copo de 4 L e de frente para a parte exposta do copo de 250 ml. Certifique-se de que o copo de 250 ml é centrada no fundo da proveta de 4 litros.
7. Posicionar um grande tela opaca por trás da taça 4L, permitindo que os animais a serem expostas, mas evitando qualquer pessoal do laboratório de ver a ponta do filamento de UV. ATENÇÃO: certifique-se esta barreira está no lugar antes de ligar o aparelho à fonte de UV.
8. Ligue a fonte de energia UV. Definir temporizador para 30 min. Coloque os rótulos de advertência necessárias para garantir que o pessoal de laboratório desavisados ​​não possa se expor à radiação UV.
9. Após 30 min, desligue a fonte de energia UV. Remover o copo de 250 ml com o peixe. NOTA: se várias rodadas de exposição UV são necessárias, deixe a fonte de alimentação esfriar (~ 20 min) antes de repetir o protocolo de exposição. Certifique-se de substituir tele 100 ml de água com sistema de água fresca para cada exposição. A água no copo de 4 L não necessita de ser substituído.

3. Lâmpada de halogéneo Luz exposição

1. Transfira o peixe do copo de 250 ml em uma L claro aquário 1,8 acrílico. Encha o tanque até a marca de transbordo.
2. Configure área de tratamento de luz a lâmpada halógena. Obter quatro de 250 W lâmpadas halógenas utilidade de uma loja de hardware local. Enfrentando duas lâmpadas na mesma direção, arranjar 29 centímetros de distância do centro. Dispor as outras duas lâmpadas de uma maneira semelhante.
   1. Coloque o segundo conjunto de lâmpadas, de modo que eles estão de frente para o primeiro conjunto de lâmpadas, deixando ~ 73 centímetros entre os dois conjuntos de lâmpadas. Isso cria uma área de tratamento de luz em forma de retângulo de 29 x 73 cm.
3. Obter um pequeno ventilador de uma loja de hardware local. Coloque o ventilador equidistante entre os dois conjuntos de lâmpadas, apenas fora da área de tratamento de luz.
4. Colocar dois tanques cheios de 1,8 L de água no centro doárea de tratamento de luz, equidistante entre os dois conjuntos de lâmpadas. A distância entre as lâmpadas e a parede externa do tanque deve ser ~ 29 cm. Nota: mesmo que apenas o tratamento de 10 peixes em um tanque de 1,8 L, use este arranjo. Ambos os tanques são necessários para manter a temperatura da água de cada tanque no intervalo apropriado.
5. Coloque um aerador de oxigênio em cada tanque.
6. Cobrir cada tanque com tampas de acrílico transparente, deixando um intervalo de ~ 2 cm na região da extremidade mais próxima do ventilador. Organizar o ventilador de modo que ele vai soprar ar para esta lacuna. Coloque um termómetro em um ou ambos os tanques.
7. Ligue a alimentação para as luzes, ventilador, e aeradores. Manter o tratamento luz por até 4 dias. O peixe não deve ser alimentado durante o tratamento com luz, como isso vai afetar a qualidade da água e resultam em mais estresse para os animais.
8. Monitorar o nível de temperatura e água em uma base diária. Manter a temperatura a 30-33 ° C. Se necessário, ajustar a velocidade do ventilador e / ou a distância entre os tanques e o lights.
   1. Top fora de cada tanque com água do sistema, conforme necessário, geralmente diária.
   2. Sempre use zebrafish adulto saudável (geralmente 6-9 meses de idade) para manter uma taxa de sobrevivência de quase 100%. No entanto, se um peixe é encontrado morto no tanque, removê-lo imediatamente e substituir a água por todo o tanque.

4. Coleção de tecidos

1. 48 horas após o início do tratamento com luz de halogéneo remover o peixe a partir da área de tratamento.
   1. Preparar fresco fixador formaldeído etanólico (1 parte de 37% de formaldeído, 9 partes de etanol a 100%).
   2. Eutanásia peixe-zebra com uma sobredose de anestésico de 2-fenoxietanol (0,4 mg / L).
   3. Transfira o peixe-zebra sacrificados a uma toalha de papel. Enuclear o olho usando uma pinça curva.
   4. Coloque olhos enucleados em fixador e loja O / N a 4 ° C.
2. Cryoprotect os olhos.
   1. Lavar os olhos em 5% de sacarose 1x PBS durante 30 min à temperatura ambiente, e depois substituir comfresco 5% de sacarose 1x PBS durante 2 h. Em seguida, lavar os olhos em sacarose a 30% PBS 1x O / N a 4 ° C. Lavar os olhos em uma mistura 1:1 (partes iguais) de meio de congelamento de tecidos e 30% de sacarose PBS 1x O / N a 4 ° C.
3. Incorporar os olhos no meio de congelamento de 100% do tecido e armazenar a -80 ° C. Oriente os olhos, de modo que cryosectioning do tecido é realizada sobre o eixo dorsal / ventral.
4. Criocorte o tecido e coloque em lâminas de vidro. Lâminas quentes para 2 horas a 55 ° C. Loja lâminas a -80 ° C ou imediatamente executar imunohistoquímica padrão.
5. Realizar imunohistoquímica padrão em tecido seccionado e imagem com microscopia fluorescente ^40,51.

Resultados

O protocolo de tratamento de luz foi anteriormente descrito em relação a cada método individual de LIRD. Nos animais tratados com albinos adultos escuro (Figuras 3-5), os tratamentos de luz individuais resultou em perda significativa de haste (Figura 3) e do cone (Figura 4) fotorreceptores. No entanto, ambos os tratamentos individuais fotorreceptores danificados, principalmente na metade dorsal da retina, deixando a retina ventral relativamente protegida dos...

Discussão

Aqui nós mostramos que a combinação de uma curta exposição UV com uma luz brilhante contínua exposição resulta em perda de fotorreceptores generalizada e uma resposta de regeneração robusta. Comparado com os métodos LIRD individuais, este método também combinado é o protocolo mais eficaz para danificar os dois cones e bastonetes em ambas as partes da retina. Importante, este tratamento é eficaz em animais pigmentadas, bem como animais albinos.

Apesar de apresentar pro...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
UV light source	Leica	EL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm)	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS3160152BO
250 ml glass beaker	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS1000250
4 L glass beaker	Sigma-Aldrich/Pyrex	CLS10004L
Aluminum foil	Fisher	01-213-105
250 W halogen lamps	Workforce	265-669
1.8 L clear acrylic tanks	Aquaneering	ZT180T
1.8 L clear acrylic tank lids	Aquaneering	ZT180LCL
Fan	Honeywell	HT-900
Aerator	Tetra	77853-900
Thermometer	Cole-Parmer	YO-08008-58
Bent forceps (5/45)	World Precision Instruments	504155