微流体平台从未经加工的全血测定中性粒细胞趋

摘要

这个协议的细节设计，从全血具有强大的可重复性一滴测量人体中性粒细胞的趋化作用的试验。这种方法绕过了必要的中性粒细胞的分离和需要测定的准备时间仅几分钟。微流控芯片使中性粒细胞的趋化作用的重复测量随着时间的推移在婴儿或小型哺乳动物，其中样品体积是有限的。

摘要

中性粒细胞在抵御感染和它们的数量在血液中发挥至关重要的作用，经常测量在诊所。在血液中较高的中性粒细胞计数通常持续感染的指标，而低中性粒细胞计数是一个警告标志的感染风险较高。为了实现其职能，中性粒细胞也必须能够有效地从那里度过大部分生命的血液移动，进入组织，在感染发生。因此，在嗜中性粒细胞的迁移能力的任何缺陷可以提高风险的感染，即使在中性粒细胞是存在于血液中的相应的数字。但是，衡量在诊所中性粒细胞迁移能力是一项艰巨的任务，这是费时，需要大量的血液，和专家知识。为了解决这些限制，我们设计了一个强大的微流体检测中性粒细胞的迁移，这需要未处理血单个液滴，circum气孔的必要性嗜中性粒细胞分离，并且容易量化的简单的显微镜。在该测定中，嗜中性粒细胞直接从血液滴，迁移通过小通道朝趋化因子的来源。为了防止通过同一信道的红血细胞的颗粒流，我们实现了机械过滤器具有直角转弯，其选择性地阻挡红细胞的前进。我们通过从手指刺和静脉血采集的血液滴比较中性粒细胞迁移的验证实验。我们还比较了这些全血（WB）的来源与中性粒细胞纯化样品中性粒细胞迁移，发现三个来源之间保持一致的速度和方向。此微流体平台将使人类中性粒细胞迁移的研究在临床和研究环境，以帮助增进我们的健康和疾病中性粒细胞功能的理解。

引言

嗜中性粒细胞贩卖起着决定的许多炎症性疾病，包括动脉粥样硬化^1，细菌感染或败血症²的进度和分辨率的关键作用，以及烧伤^3。对于健康和疾病状况做出的巨大贡献，中性粒细胞计数的标准血液分析通常被认为在临床和科研实验室的一部分。然而，尽管是一种最普遍的测试，中性粒细胞计数在感染和败血症的诊断价值已频频质疑^4。例如，在烧伤病人的中性粒细胞的一项研究发现，嗜中性粒细胞计数和中性粒细胞迁移的功能不相关;标志着单独的中性粒细胞计数是不是免疫状态³的准确指标。虽然越来越多的难以衡量，中性粒细胞功能的能力提出了更有价值的各种条件。

T“>重要的是，许多嗜中性粒细胞缺陷是短暂的，不会被永久的遗传缺陷，已经在很大程度上忽略了诊所，直到最近的区分触发。在烧伤的情况下，中性粒细胞迁移能的过程中被监控病人的治疗，炎症状态或感染³的指标。目前在实验室（Boyden小室，邓恩室，微量法）使用传统迁移实验不能转换成临床上，因为它们需要大量的血液和繁琐费时嗜中性粒细胞分离技术（ 表1）。这些测定也不能用来监测在小的实验室动物，如小鼠的嗜中性粒细胞趋化性的瞬时变化，由于血液所需的嗜中性粒细胞隔离的体积只允许有一个样品甚至常常需要汇集血液从多个动物为一个单一的测定，例如，涉及的研究米在多个时间点ultiple条件和治疗方法可以使用​​目前的趋化实验可能需要上千小鼠。这限制了基础生物学研究是可以做到的，了解的损伤，感染的情况下免疫功能的复杂动态或烧伤经常研究在小鼠模型^5。

以满足对嗜中性粒细胞功能测定法是快速，健壮，同时要求最小的血液量，我们已经开发了直接从一个小液滴的全血测定中性粒细胞趋化性的微流体装置。它是已知的许多因素中的全血，血清，包括⁶和血小板^7，影响嗜中性粒细胞的功能。因此，它是有益的，该全血的微流体测定最大限度地减少样品处理测量的变化趋当与体外测定⁸维持体内微环境中的中性粒细胞。这种方法降低时间从采血到使用传统技术时中性粒细胞迁移实验，以短短几分钟内（ 表1）。全血的微流体平台产生用于实验的长度的稳定的线性趋化梯度，没有移动部件，并且不需要外部压力源（ 例如注射器泵）。在全血中的微流体设备的设计中的关键特征是红细胞（RBC）的过滤梳机械地过滤进入设备的迁移通道的RBCs的掺入。这个过滤梳的右转弯防止需要排阻过滤，这将可能由红细胞堵塞，因此到达在WB的积极迁移阻断中性粒细胞趋化梯度。全血的微流体装置的一个12或24孔板的掺入促进人或鼠中性粒细胞趋化性的Si多种介质的筛分multaneously。

研究方案

1，微流控设备制造

1. 使用标准光刻技术，制作了1000级洁净室的母模晶片。图案的第3μm的薄环氧系负光刻胶层，根据来自制造商的说明来定义迁移通道。图案的第二50微米厚的层来定义小区负载和趋化因子的腔室。
2. 使用图案化的晶片投聚二甲基硅氧烷（PDMS）的设备。大力混合的PDMS（20克）与引发剂（2克），使用塑料叉子在大型塑料托盘称重5分钟。
3. 小心倒出的PDMS模具上。
4. 通过将模具与浇注PDMS在真空干燥器中进行1小时脱气PDMS。
5. 烘烤并在烘箱中设定为65℃固化至少3小时的PDMS微流体装置
6. 冲出来用冲床具有1.5毫米的尖端直径中央WBLCs。
7. 使用punc则为切出整个环形装置她的为5.0毫米的尖端直径。
8. 使用胶带甜甜圈设备去除水中的微粒。
9. 冲洗12孔板，用去离子水，然后用干燥的氮气。放置板在60℃的烘箱中持续5分钟。
10. 氧等离子体处理的12孔板的两倍;再次单独为35秒，然后用另一个35秒的甜甜圈设备。
11. 小心将设备中使用镊子板的孔中。
12. 烘烤板与上热板设定为80℃下进行10分钟的连结装置。

2，微流控检测制剂

1. 氧等离子体处理后，立即素的微流体装置时，该设备是亲水性的毛细管作用可促进在器件中的小通道的起动。
2. 将5微升的fMLP [原液10微米]与5微升纤维连接蛋白[原液1毫克/毫升]和490微升的HBSS创建趋化解决方案。
3. 慢慢的移液管＆＃160;趋化溶液成WBLC，使用凝胶加载提示（ 图1A）。移液管的额外20微升围绕该装置的外部的趋化。
4. 放置板在干燥器中15分钟。通过将真空施加到该装置，将溶液滴入侧通道的装置和移位的空气扩散通过所述PDMS的。
5. 从干燥器中取出板和显微镜下确认设备通道的润湿性。看着泡变小趋化解决方案进入室内。没有泡沫应该是经过真空处理装置内的存在。
6. 洗WBLC和装置外部彻底除去过量的趋化溶液。这个步骤产生趋化从每个焦点趋化室（FCC的）到设备中心渐变。
   1. 补一个1毫升的注射器用PBS，加30 G钝针尖注射器。轻轻地插入在注射器的针尖到圆环孔的中心。轻轻推100μl的PBS中成孔以使PBS的形式在设备的顶部的液滴。
   2. 倾斜板和移液管1ml的PBS周围装置，以使液体收集在井的底部。吸出液体，然后重复过程总的3倍使用（而不是使用缓冲介质，如果分离的嗜中性粒细胞会在介质上加载）新鲜的缓冲溶液^9。
7. 每个媒体以及填补，直到设备的顶部下液体被淹没。让设备静置15分钟，使梯度达到稳定。实验结果和有限元模拟的理论数据表明，在这些设备中的梯度稳定长达24小时，小分子（ 例如 ，的fMLP）和最多为大分子量（ 例如 IL8）一个数天。
8. 用凝胶加载提示，慢慢吸取2微升血液（或孤立的中性粒细胞）到每个全血洛阿鼎室（WBLC）（ 图1A）。

3，样品制备

人类嗜中性粒细胞从毛细血管血

1. 收集毛细血管血液从健康志愿者，谁是没有免疫抑制剂的手指刺。所有病人的样本，并以书面的知情同意书获得，并通过批准的麻省总医院和施赖纳斯机构审查委员会的程序。
   1. 对于扎手指采血，洗手用水和肥皂和干燥的皮肤。加入1 ml HBSS + 0.2％HSA和10微升的Hoechst染色（32.4微米）到肝素的血液收集管（1.65 USP/50微升血液）准备anti-coagulant/stain原液。使用SurgiLance安全柳叶刀（2.2毫米深，22 G）刺破手指，擦干血第一滴，收集50微升的血液在Eppendorf管中含有股票抗凝血剂和赫斯特荧光染料溶液（10微升），轻轻混合。
2. 孵育血液和Hoechst的染色10分钟，以允许核荧光染色。 1小时内采血运行示例。

人类嗜中性粒细胞从静脉血

3. 画出加入10ml外周血，静脉血入含有33美国药典肝素管。
4. 加入50微升的静脉血媒体和赫斯特染色如前所述。孵育血液和Hoechst的染色10分钟，以允许核荧光染色。 1小时内采血运行示例。

中性粒细胞分离从全血 - 阳性对照

5. 分离中性粒细胞，使用无菌技术，从使用羟乙基淀粉10毫升静脉全血样品中分离嗜中性粒细胞（6％重量/体积）密度梯度后跟一个阴性选择磁珠分离试剂盒按照制造商的协议。
6. 嗜中性粒细胞重悬的最后等分试样在concentr通报BULLETIN 4000个/μl在1X HBSS + 0.2％的人血清白蛋白。细胞保持在37°C，直到准备好运行实验。

4，显微镜和图像分析为中性粒细胞趋化测量

1. 设置biochamber温度至37℃，湿度为80％，和CO ₂为5％。
2. 开始使用时间推移成像在显微镜（10X或更高的放大倍率）立即成像。

5，统计分析

1. 每个样本中手动追踪至少50中性粒细胞。
2. 计数结束时进入FCC的细胞（ 图2）。
3. 计算嗜中性粒细胞的速度在使用ImageJ（NIH）（ 图2）WBLC和FCC之间的信道。
4. 通过计数细胞，通过分叉的数量，并计算细胞的转向FCC和细胞退出次的数量之间的比率量化嗜中性粒细胞的方向性E设备。细胞是不定向不遵循趋化梯度，因此迁移朝向FCC和出口流道（ 图2）相等的数字。

结果

全血（WB）中性粒细胞的趋化性试验，通过测量中性粒细胞朝着渐变的fMLP（ 动画S1）的积累验证。结果证实，红细胞通过的过滤梳困而嗜中性粒细胞（蓝色）能够积极地迁移出的全血（ 图3A和电影S1）。由全血的微流体装置所形成的稳定的线性趋化梯度（绿色）用FITC-标记的葡聚糖（ 图3A中的插图）的确定和测量的荧光水平随着时间的推移。在这?...

讨论

在这项工作中，我们开发了一个微流体平台，从血液滴（2微升）测量嗜中性粒细胞的趋化性。红细胞从积极的中性粒细胞迁移的芯片上的机械过滤规避了繁琐的细胞分离方法如密度梯度^10，正选择¹¹或阴性选择^12，这很容易通过激活嗜中性粒细胞引入伪像。红细胞的机械过滤区分我们的技术与其他微流控芯片，用于探测中性粒细胞迁移。例如，从本实验室¹³和以往?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Fabrication
SU-8	Microchem	Y131273
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184 1.1 lb. Kit
Standard glass slides	Fisher Scientific	125495	1 X 3 inches
Glass-bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm	Ted Pella, Inc.	15081
Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm	Ted Pella, Inc.	15072
Microfluidic Assay Preparation and Analysis
Gel-loading pipet tip	Fisher Scientific	02-707-139
Syringe	Fisher Scientfic	309602
Blunt tip needle, 30 G ½ in.	Brico Medical Supply	BN3005
Vacutainer, Heparin	Becton Dickinson
HBSS	Sigma-Aldrich
Human serum albumin	Sigma-Aldrich	A5843-5G	0.2% final concentration in HBSS
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895-1MG
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G		SLN240
Hoescht stain	Life Technologies	H3570
Positive Control
HetaSep	STEMCELL Technologies Inc.	7906
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies Inc.	19257
Plasma Asher	March Instruments	P-250
Lindberg/Blue M Oven	Thermo Scientific	13-258-30C
Stainless Steel Precision Tweezers	Techni Tool	758TW458
Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator	Fisher Scientific	08-594-15A
Dataplate Digital Hot Plate	Alpha Multiservices	PMC 720
Nikon TiE inverted microscope	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MEA53100
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MRH20101
Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters	Chroma - Micro Video Instruments Inc.	31013v2
Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels	Qimaging - Micro Video Instruments Inc.	RET-2000R-F-M-12-C