Plataforma de microfluidos para la medición de quimiotaxis de neutrófilos a partir de sangre entera sin procesar

Resumen

Este protocolo detalla un ensayo diseñado para medir la quimiotaxis de neutrófilos humanos a partir de una gotita de sangre entera con robusta reproducibilidad. Este enfoque evita la necesidad de la separación de neutrófilos y requiere sólo unos pocos minutos de ensayo de tiempo de preparación. El chip de microfluidos permite la medición repetida de la quimiotaxis de neutrófilos en el tiempo en los bebés o pequeños mamíferos, donde el volumen de la muestra es limitado.

Resumen

Los neutrófilos desempeñan un papel esencial en la protección contra las infecciones y sus números en la sangre se miden con frecuencia en la clínica. Altos recuentos de neutrófilos en la sangre suelen ser un indicador de las infecciones en curso, mientras que los recuentos bajos de neutrófilos son una señal de advertencia para los mayores riesgos para las infecciones. Para llevar a cabo sus funciones, los neutrófilos también tienen que ser capaces de moverse con eficacia de la sangre donde pasan la mayor parte de su vida, en los tejidos, en los que se producen las infecciones. En consecuencia, cualquier defecto en la capacidad de los neutrófilos para migrar pueden aumentar los riesgos de infecciones, incluso cuando los neutrófilos están presentes en números apropiados en la sangre. Sin embargo, la medición de la capacidad de migración de los neutrófilos en la clínica es una tarea difícil, que requiere tiempo, requiere gran volumen de sangre, y el conocimiento de expertos. Para hacer frente a estas limitaciones, hemos diseñado un robusto análisis de microfluidos para la migración de neutrófilos, que requiere una sola gota de sangre no procesada, circumrespiraderos la necesidad de la separación de neutrófilos, y es fácil de cuantificar en un microscopio sencillo. En este ensayo, los neutrófilos migran directamente de la gota de sangre, a través de pequeños canales, hacia la fuente de quimioatrayente. Para evitar que el flujo granular de células rojas de la sangre a través de los mismos canales, se implementó filtros mecánicos con ángulo de giros a la derecha que bloquean selectivamente el avance de las células rojas de la sangre. Hemos validado el ensayo comparando la migración de neutrófilos a partir de gotas de sangre de pinchazo en el dedo y la sangre venosa. También comparamos todo esto en la sangre (WB) con fuentes de la migración de neutrófilos a partir de muestras de neutrófilos purificados y encontramos la velocidad constante y direccionalidad entre las tres fuentes. Esta plataforma de microfluidos permitirá el estudio de la migración de neutrófilos humanos en la clínica y el marco de la investigación para ayudar a avanzar nuestra comprensión de las funciones de los neutrófilos en la salud y la enfermedad.

Introducción

El tráfico de neutrófilos juega un papel crítico en la determinación del progreso y la resolución de muchas condiciones inflamatorias, incluyendo la aterosclerosis ^1, la infección bacteriana o la sepsis ^2, y lesiones por quemadura ^3. Por su importante contribución a las condiciones de salud y enfermedad, el recuento de neutrófilos es parte del análisis de sangre estándar a menudo se considera en los laboratorios clínicos y de investigación. Sin embargo, a pesar de ser una de las pruebas más ubicuos, el valor de recuento de neutrófilos en el diagnóstico de la infección y la sepsis se ha cuestionado con frecuencia ^4. Por ejemplo, un estudio de los neutrófilos en pacientes con quemaduras reveló que el recuento de neutrófilos y la función de la migración de neutrófilos no se correlacionan; lo que significa que el recuento de neutrófilos por sí sola no es un indicador preciso del estado inmunológico ^3. Aunque más difícil de medir, la competencia funcional de neutrófilos ha sido propuesta como más valioso en una amplia gama de condiciones.

t "> Es importante destacar que muchos de los defectos de neutrófilos son transitorias y no se activan por defectos genéticos permanentes, una distinción que se ha pasado por alto en gran medida en la clínica hasta hace poco. En el contexto de las lesiones por quemaduras, la migración de neutrófilos podría ser monitoreado durante el curso de tratamiento de un paciente como un indicador de estado inflamatorio o infección ^3. ensayos de migración tradicionales utilizados actualmente en el laboratorio (cámara de Boyden, cámara de Dunn, ensayo de micropipeta) no se puede traducir en un entorno clínico, ya que requieren grandes volúmenes de sangre y engorroso que consume tiempo técnicas de aislamiento de neutrófilos (Tabla 1). Estos ensayos también pueden no ser usados ​​para monitorear los cambios transitorios en la quimiotaxis de neutrófilos en pequeños animales de laboratorio, tales como ratones, ya que el volumen de sangre necesaria para el aislamiento de neutrófilos permite sólo una muestra y, a menudo incluso requiere la puesta en común de sangre de múltiples animales para un único ensayo. Por ejemplo, un estudio que implicaba mcondiciones ultiple y tratamientos a través de múltiples puntos de tiempo potencialmente podrían requerir miles de ratones utilizando ensayos de quimiotaxis actuales. Esto restringe la investigación biológica básica que se puede hacer para comprender la compleja dinámica de la función inmune en el contexto de una lesión, infección o quemadura frecuentemente estudiado en los modelos murinos ^5.

Para abordar la necesidad de un ensayo funcional de neutrófilos que es rápido, robusto, mientras que requiere un mínimo de volumen de sangre, hemos desarrollado un dispositivo de microfluidos que mide la quimiotaxis de neutrófilos directamente desde una pequeña gota de sangre entera. Se sabe que muchos factores en la sangre entera, incluyendo suero ⁶ y ⁷ plaquetas, afectan a la función de los neutrófilos. Por lo tanto, es beneficioso que todo el ensayo microfluídico sangre minimiza procesamiento de la muestra para mantener el microambiente in vivo de los neutrófilos en la medición de las variaciones en la quimiotaxis con un ensayo in vitro ^8. Este enfoquereduce el tiempo de recogida de sangre para ensayos de migración de neutrófilos de horas utilizando técnicas tradicionales, a pocos minutos (Tabla 1). La plataforma de microfluidos sangre completa produce un gradiente lineal quimioatrayente estable para la duración del experimento, no tiene partes móviles, y no requiere una fuente de presión externa (es decir, bomba de jeringa). La característica clave en el diseño de todo el dispositivo de microfluidos sangre es la incorporación de un glóbulo rojo (RBC) de peine de filtración que filtra mecánicamente los glóbulos rojos de entrar en el canal de la migración del dispositivo. Los giros a la derecha de este peine filtración evitan la necesidad de filtración de exclusión de tamaño, lo que probablemente se atasca con los glóbulos rojos y por lo tanto bloquean el gradiente quimiotáctico de alcanzar los neutrófilos migran activamente en el BM. La incorporación de todo el dispositivo de microfluidos sangre en una placa de 12 o 24 pocillos facilita la detección de múltiples mediadores de Si la quimiotaxis de neutrófilos humana o murinasimultáneamente.

Protocolo

1. Fabricación de dispositivos de microfluidos

1. Utilizando técnicas de fotolitografía estándar, fabricar el molde de la oblea maestro en una clase 1000 habitación limpia. Patrón de la primera capa de resina fotosensible 3-m-delgada a base de epóxido negativo para definir los canales de migración de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Patrón de la segunda capa de 50 micras de espesor para definir las cámaras de células de carga y de quimiocinas.
2. Utilice la oblea con dibujos para echar polidimetilsiloxano (PDMS) dispositivos. Vigorosamente la mezcla de PDMS (20 g) con iniciador (2 g) durante 5 min usando tenedor de plástico en gran bandeja de pesada de plástico.
3. Vierta cuidadosamente PDMS en molde.
4. Desgasificar la PDMS mediante la colocación de molde con PDMS vierte en un desecador de vacío durante 1 hora.
5. Hornear y curar PDMS dispositivos de microfluidos para al menos 3 horas en un horno a 65 ° C.
6. Rompa las WBLCs centrales utilizando un golpeador con un diámetro de la punta de 1,5 mm.
7. Rompa los dispositivos en forma de rosquilla enteros usando una punciónella con un diámetro de la punta de 5,0 mm.
8. Remueva las partículas de los dispositivos de rosquilla con cinta adhesiva.
9. Enjuague una placa de 12 pocillos con agua desionizada y secar con nitrógeno. Colocar la placa en el horno 60 ° C durante 5 min.
10. El plasma de oxígeno a tratar la placa de 12 pocillos dos veces; una vez solo por 35 segundos y luego otra vez con los dispositivos de donuts para otros 35 seg.
11. Coloque con cuidado los dispositivos en los pocillos de la placa con unas pinzas.
12. Placa Hornear con dispositivos unidos en una placa caliente ajustada a 80 ° C durante 10 min.

2. Microfluidic Preparación del ensayo

1. Dispositivos de microfluidos Prime inmediatamente después del tratamiento con plasma de oxígeno, cuando el dispositivo es hidrófilo y efectos capilares puede promover el cebado de los pequeños canales en el dispositivo.
2. Cree solución quimioatrayente mezclando 5 l fMLP [solución madre 10 mM] con 5 l fibronectina [solución madre de 1 mg / ml] y 490 l HBSS.
3. Lentamente pipeta & #160; solución quimioatrayente en WBLC, usando una punta de carga de gel (Figura 1A). Pipet un adicional de 20 l de la quimioatrayente alrededor del exterior del dispositivo.
4. Colocar la placa en un desecador durante 15 min. Mediante la aplicación de un vacío en el dispositivo, la solución se instila en los canales laterales del dispositivo y el aire desplazado difundido fuera a través de los PDMS.
5. Retire la placa de desecador y confirmar la humectación de canal del dispositivo bajo el microscopio. Mira como la burbuja se hace más pequeño como solución quimioatrayente entra en la cámara. Sin burbuja debe estar presente en el dispositivo después de un tratamiento de vacío.
6. Lavar el WBLC y fuera del dispositivo a fondo para eliminar el exceso de solución quimioatrayente. Este paso genera un gradiente de quimioatrayente de cada una de las cámaras de quimiotaxis focales (FCC) franceses al centro del dispositivo.
   1. Llene una jeringa de 1 ml con PBS, añadir una punta de aguja roma 30 G a la jeringa. Suavemente, inserte la punta de la aguja de la jeringa enal centro del agujero de donut. Empuje suavemente 100 l de PBS en el agujero de manera que una gota de formas de PBS en la parte superior del dispositivo.
   2. Placa de la inclinación y de pipeta 1 ml de PBS alrededor de dispositivo de modo que el líquido se acumula en la parte inferior del pozo. Aspirar el líquido y repetir el proceso para un total de 3 veces utilizando solución tampón fresca (uso de memoria en lugar de tampón si los neutrófilos separados serán cargados en los medios) ^9.
7. Llene cada pocillo con los medios de comunicación hasta las copas de los dispositivos están sumergidas bajo el líquido. Deje que los dispositivos se sientan durante 15 minutos para permitir la gradiente se estabilice. Los resultados experimentales y los datos teóricos de simulaciones de elementos finitos muestran que los gradientes en estos dispositivos son estables hasta 24 h para las pequeñas moléculas (por ejemplo, fMLP) y hasta un varios días de mayor peso molecular (por ejemplo, IL-8).
8. Utilizando puntas de carga de gel, con la pipeta lentamente 2 l de sangre (o neutrófilos aislados) en conjunto cada loa sangreDing cámara (WBLC) (Figura 1A).

3. Preparación de la muestra

Los neutrófilos humanas De sangre capilar

1. Recoger la sangre capilar del pinchazo en el dedo del voluntario sano, que está en ninguna inmunosupresores. Todas las muestras de los pacientes se obtuvieron con el consentimiento informado por escrito, ya través de los procedimientos aprobados por el MGH y Shriners Juntas de Revisión Institucional.
   1. Para la recolección de la sangre pinchazo en el dedo, lavar las manos con agua y jabón y secar la piel. Preparar solución madre anti-coagulant/stain mediante la adición de 1 ml de HBSS + 0,2% de HSA y 10 l tinción de Hoechst (32,4 M) a la heparina tubo de recogida de sangre (1,65 USP/50 l de sangre). Pinchar el dedo utilizando una lanceta de seguridad SurgiLance (profundidad de 2,2 mm, 22 G), limpie primera gota de sangre y recoger 50 l de sangre en un tubo Eppendorf que contiene la acción anticoagulante y solución de tinción fluorescente Hoechst (10 l) y suavemente mezclar.
2. Incubar la sangre y tinción de Hoechst durante 10 min para permitir la tinción fluorescente núcleo. Ejecute la muestra dentro de 1 hora de la recogida de sangre.

Los neutrófilos humanas De Sangre venosa

3. Dibujar 10 ml de sangre periférica, venosa en tubos que contenían heparina USP 33.
4. Añadir 50 l de sangre venosa a los medios de comunicación y tinción de Hoechst como se describe anteriormente. Incubar la sangre y tinción de Hoechst durante 10 min para permitir la tinción fluorescente núcleo. Ejecute la muestra dentro de 1 hora de la recogida de sangre.

Neutrófilos Separación De Sangre Entera - Control Positivo

5. Para separar los neutrófilos, utilizar técnicas estériles para aislar los neutrófilos de la 10 ml de muestra de sangre entera venosa usando hetastarch (6% w / v) gradiente de densidad seguido de un kit de aislamiento de selección negativa con perlas magnéticas siguiendo el protocolo de los fabricantes.
6. Se resuspendieron la alícuota final del neutrófilos a una Concentración de 4.000 células / mu l en 1X HBSS + 0,2% de albúmina de suero humano. Mantener las células a 37 ° C hasta el momento de realizar el experimento.

4. Microscopia y Análisis de Imágenes para la quimiotaxis de neutrófilos Medidas

1. Ajustar la temperatura biochamber a 37 ° C, humedad del 80% y CO ₂ al 5%.
2. Comience obtener imágenes inmediatamente usando time-lapse en un microscopio (10X o mayor aumento).

5. Análisis estadístico

1. Pista manualmente al menos 50 neutrófilos en cada muestra.
2. Contar las células que entran en la FCC con el tiempo (Figura 2).
3. Cálculo de las velocidades de neutrófilos en el canal entre WBLC y FCC usando ImageJ (NIH) (Figura 2).
4. Cuantificar la direccionalidad de los neutrófilos mediante el recuento del número de células que pasan a la bifurcación y el cálculo de la relación entre el número de células que se vuelven hacia la FCC y las células que la salida ªe dispositivo. Las células que no son direccionales no siguen el gradiente quimiotáctico y por lo tanto migran en números iguales hacia la FCC y el canal de salida (Figura 2).

Resultados

Todo el ensayo de quimiotaxis de neutrófilos en sangre (BM) se validó mediante la medición de la acumulación de neutrófilos hacia un gradiente de fMLP (Película S1). Los resultados confirman que los glóbulos rojos son atrapados por el peine de filtración, mientras que los neutrófilos (azul) son capaces de migrar activamente a cabo de toda la sangre (Figura 3A y la película de S1). El gradiente estable lineal quimioatrayente (verde), formada por todo el disposi...

Discusión

En este trabajo, hemos desarrollado una plataforma de microfluidos para medir la quimiotaxis de neutrófilos a partir de una gota de sangre (2 l). La filtración mecánica en el chip de los glóbulos rojos de la migración de neutrófilos activamente evita la necesidad de métodos engorrosos de separación de células tales como gradientes de densidad ^10, la selección positiva ^11, o selección negativa ^12, que son propensos a introducir artefactos mediante la activación de los neutróf...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Fabrication
SU-8	Microchem	Y131273
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184 1.1 lb. Kit
Standard glass slides	Fisher Scientific	125495	1 X 3 inches
Glass-bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm	Ted Pella, Inc.	15081
Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm	Ted Pella, Inc.	15072
Microfluidic Assay Preparation and Analysis
Gel-loading pipet tip	Fisher Scientific	02-707-139
Syringe	Fisher Scientfic	309602
Blunt tip needle, 30 G ½ in.	Brico Medical Supply	BN3005
Vacutainer, Heparin	Becton Dickinson
HBSS	Sigma-Aldrich
Human serum albumin	Sigma-Aldrich	A5843-5G	0.2% final concentration in HBSS
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895-1MG
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G		SLN240
Hoescht stain	Life Technologies	H3570
Positive Control
HetaSep	STEMCELL Technologies Inc.	7906
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies Inc.	19257
Plasma Asher	March Instruments	P-250
Lindberg/Blue M Oven	Thermo Scientific	13-258-30C
Stainless Steel Precision Tweezers	Techni Tool	758TW458
Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator	Fisher Scientific	08-594-15A
Dataplate Digital Hot Plate	Alpha Multiservices	PMC 720
Nikon TiE inverted microscope	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MEA53100
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MRH20101
Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters	Chroma - Micro Video Instruments Inc.	31013v2
Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels	Qimaging - Micro Video Instruments Inc.	RET-2000R-F-M-12-C