Plataforma microfluídica para medição de quimiotaxia de neutrófilos não transformados Sangue Total

Resumo

Este protocolo detalha um ensaio concebido para medir a quimiotaxia de neutrófilos humanos a partir de uma gota de sangue total com reprodutibilidade robusta. Esta abordagem evita a necessidade de separação de neutrófilos e requer apenas alguns minutos de ensaio tempo de preparação. O chip de microfluídica permite a medida repetida de quimiotaxia de neutrófilos ao longo do tempo em crianças ou pequenos mamíferos, onde o volume da amostra é limitado.

Resumo

Os neutrófilos desempenham um papel essencial na proteção contra infecções e seus números no sangue são freqüentemente medido na clínica. Maiores número de neutrófilos no sangue são geralmente um indicador de infecções em curso, enquanto a baixa contagem de neutrófilos são um sinal de alerta para os riscos mais elevados para infecções. Para realizar as suas funções, os neutrófilos, também tem que ser capaz de se mover de forma eficaz a partir do sangue, onde eles passam a maior parte de sua vida, para os tecidos, onde ocorrem infecções. Consequentemente, quaisquer defeitos na capacidade dos neutrófilos para migrar pode aumentar os riscos de infecções, mesmo quando os neutrófilos estão presentes em números adequados no sangue. No entanto, a medição de neutrófilos capacidade de migração na clínica é uma tarefa desafiadora, que é demorado, exige grande volume de sangue, e conhecimento especializado. Para lidar com essas limitações, nós projetamos um robusto ensaios microfluídicos para a migração de neutrófilos, o que requer uma única gota de sangue não transformados, circumvents a necessidade de separação dos neutrófilos, e é fácil de quantificar num microscópio simples. Neste ensaio, os neutrófilos migram directamente a partir da gota de sangue, através de pequenos canais, no sentido da fonte do quimioatractor. Para evitar que o fluxo granular de células vermelhas do sangue através dos mesmos canais, implementamos filtros mecânicos com ângulo direito voltas que bloquear seletivamente o avanço das células vermelhas do sangue. Nós validamos o ensaio comparando a migração de neutrófilos de gotas de sangue coletadas de punção digital e sangue venoso. Também comparamos todo estes sangue (BM) fontes com migração de neutrófilos a partir de amostras de neutrófilos purificados e encontrou velocidade consistente e direcionalidade entre as três fontes. Esta plataforma microfluídica permitirá o estudo da migração de neutrófilos humano na clínica e no ambiente de pesquisa para ajudar a avançar a nossa compreensão das funções de neutrófilos na saúde e na doença.

Introdução

Tráfico de neutrófilos desempenha um papel fundamental na determinação do progresso e resolução de muitas doenças inflamatórias, incluindo aterosclerose ^1, infecção bacteriana ou sepsia ^2, lesão por queimadura e ^3. Por sua grande contribuição para as condições de saúde e doença, contagem de neutrófilos é parte da análise de sangue padrão muitas vezes considerado em laboratórios clínicos e de pesquisa. No entanto, apesar de ser um dos testes mais ubíquos, o valor de contagem de neutrófilos para o diagnóstico da infecção e sépsis tem sido frequentemente questionada ^4. Por exemplo, um estudo de neutrófilos em pacientes com queimaduras revelou que a contagem de neutrófilos e função de migração de neutrófilos não se correlacionam; significando contar que neutrófilos por si só não é um indicador preciso do estado imunológico ^3. Embora mais difícil de medir, competência funcional de neutrófilos tem sido proposta como mais valioso em uma ampla gama de condições.

t "> É importante, muitos dos defeitos de neutrófilos são transientes e não são provocados por defeitos genéticos permanentes, uma distinção que tem sido largamente ignorada na clínica até recentemente. No contexto de queimaduras, a migração de neutrófilos pode ser monitorizada durante o curso de o tratamento de um paciente como um indicador do estado inflamatório ou infecção ^3. ensaios de migração tradicionais actualmente utilizados no laboratório (câmara de Boyden, Dunn câmara, ensaio micropipeta) não pode ser traduzido em um ambiente clínico porque requerem grandes volumes de sangue e pesado demorado técnicas de isolamento de neutrófilos (Tabela 1). Estes ensaios também não pode ser usado para monitorar as mudanças transitórias na quimiotaxia de neutrófilos em animais de laboratório pequenos, tais como ratos, porque o volume de sangue necessário para o isolamento de neutrófilos permite apenas um exemplo e muitas vezes até mesmo exige conjugação de sangue de vários animais para um único ensaio. Por exemplo, um estudo envolvendo mcondições ultiple e tratamentos ao longo de vários pontos temporais poderiam exigir milhares de ratos usando ensaios de quimiotaxia atuais. Isso restringe a pesquisa biológica básica que pode ser feito para compreender a complexa dinâmica da função imune no contexto de lesão, infecção ou queimar freqüentemente estudados em modelos murinos ^5.

Para satisfazer a necessidade de um ensaio funcional de neutrófilos que é rápida e robusta, enquanto o volume de sangue que exige um mínimo, temos desenvolvido um dispositivo de microfluidos, que mede a quimiotaxia de neutrófilos directamente a partir de uma pequena gota de sangue completo. Sabe-se que muitos fatores em sangue total, incluindo soro ⁶ e ⁷ plaquetas, afetar a função dos neutrófilos. Por conseguinte, é benéfico que o doseamento de microfluidos sangue total minimiza o processamento da amostra para manter o microambiente in vivo dos neutrófilos ao medir variações de quimiotaxia com um ensaio in vitro ^8. Esta abordagemreduz o tempo de coleta de sangue para testes de migração de neutrófilos de horas usando técnicas tradicionais, a poucos minutos (Tabela 1). A plataforma de microfluidos sangue total produz um gradiente linear quimioatractiva estável durante a duração da experiência, não tem partes móveis, e não necessita de uma fonte de pressão exterior (isto é, uma bomba de seringa). A característica-chave no desenho de conjunto do dispositivo de microfluidos de sangue é a incorporação de uma célula de sangue vermelho (RBC) pente filtração que filtra mecanicamente GVs de entrar no canal de migração do dispositivo. As voltas à direita deste pente filtração evitar a necessidade de filtração exclusão de tamanho, o que provavelmente seriam obstruídos por hemácias e, portanto, bloquear o gradiente chemoattractant de atingir os neutrófilos migram ativamente na WB. A incorporação de todo o dispositivo de microfluidos de sangue em uma placa de 12 ou 24 poços facilita o rastreio de vários mediadores de si quimiotaxia de neutrófilos humana ou murinataneamente.

Protocolo

1. Fabricação de dispositivos microfluídicos

1. Usando técnicas de fotolitografia padrão, fabricar o wafer molde mestre em uma classe de 1000 sala limpa. Padrão da primeira camada de material fotosensitivo 3 mícrons-fina à base de epóxi negativo para definir os canais de migração de acordo com as instruções do fabricante. Padrão a segunda camada de 50 mícrons de espessura para definir as câmaras de célula de carga e quimiocinas.
2. Use o wafer padronizada para lançar dispositivos polidimetilsiloxano (PDMS). Misture vigorosamente PDMS (20 g) com o iniciador (2 g) durante 5 min usando garfo de plástico, em grande bandeja de pesagem de plástico.
3. Com cuidado, despeje PDMS para molde.
4. Desgasificar o PDMS pela colocação do molde com PDMS vertida num exsicador de vácuo durante 1 hora.
5. Asse e curar PDMS dispositivos de microfluidos para, pelo menos, 3 horas num forno regulado para 65 ° C.
6. Perfurar os WBLCs centrais usando um perfurador com um diâmetro da ponta de 1,5 mm.
7. Retire o dispositivos em forma de anel inteiras usando uma punçãoela com um diâmetro da ponta de 5,0 mm.
8. Remova as partículas a partir de dispositivos de rosca com fita adesiva.
9. Lavar a 12 poços placa com água deionizada e, em seguida, seco com nitrogênio. Colocar em placa a 60 ° C forno durante 5 min.
10. Plasma de oxigénio tratar a placa de 12 poços por duas vezes; uma vez sozinho por 35 segundos e, em seguida, novamente com os dispositivos de rosca para outros 35 seg.
11. Com cuidado, coloque os dispositivos nos poços da placa, usando uma pinça.
12. Asse placa com dispositivos ligados em uma placa quente definida como 80 ° C durante 10 min.

2. Microfluidic Ensaio Preparação

1. Dispositivos de microfluidos Prime imediatamente após o tratamento por plasma de oxigénio, quando o dispositivo é hidrófilo e os efeitos capilares pode promover a iniciação dos pequenos canais no dispositivo.
2. Criar solução quimioatractiva pela mistura de 5 mL de fMLP [solução stock 10 uM] com 5 mL de fibronectina [solução de estoque de 1 mg / mL] e 490 uL de HBSS.
3. Lentamente pipeta & #160; solução quimioatractiva em WBLC, utilizando uma ponta de carga do gel (Figura 1A). Pipeta um adicional de 20 ul de quimioatractor em torno do exterior do dispositivo.
4. Coloque a placa num secador durante 15 minutos. Através da aplicação de um vácuo para o dispositivo, a solução é instilada nos canais laterais do dispositivo e o ar deslocado difundido para fora através das PDMS.
5. Retire a placa de exsicador e confirmar umedecimento do canal dispositivo sob microscópio. Veja como bolha torna-se menor, como solução chemoattractant entra na câmara. Nenhuma bolha deve estar presente no interior do dispositivo após o tratamento a vácuo.
6. Lava-se a WBLC e fora do dispositivo completamente para remover o excesso de solução quimioatractor. Este passo produz um gradiente de quimioatractor de cada uma das câmaras quimiotáticos focais (FCC) para o centro do dispositivo.
   1. Encha uma seringa de 1 ml com PBS, adicionar uma 30 G contundente ponta da agulha de seringa. Gentilmente, insira a ponta da agulha da seringa nopara o centro do orifício de rosca. Suavemente empurrar 100 ul de PBS no orifício de modo a que uma gotícula de formas de PBS na parte superior do dispositivo.
   2. Placa de inclinação e de pipeta de 1 ml de PBS em torno do dispositivo de modo a que o líquido se acumula na parte inferior do poço. Aspirar o processo líquido e repita para o total de 3x usando solução tampão fresco (media de uso em vez de buffer se os neutrófilos separados serão carregados em media) ^9.
7. Encher cada poço com a mídia até que os topos dos dispositivos estão submersos sob líquido. Deixe os dispositivos descansar por 15 min para permitir inclinação a se estabilizar. Os resultados experimentais e os dados teóricos obtidos em simulações de elementos finitos mostram que os gradientes em estes dispositivos são estáveis ​​até cerca de 24 horas, para as moléculas pequenas (por exemplo, fMLP) e até um de vários dias para o maior peso molecular (por exemplo, IL8).
8. Usando Dicas para colocar o gel, lentamente pipeta 2 mL de sangue (neutrófilos ou isoladas) em cada loa sangue totalding câmara (WBLC) (Figura 1A).

3. Preparação de Amostras

Os neutrófilos humanas A partir de sangue capilar

1. Coletar sangue capilar de punção digital de voluntários saudáveis, que está em nenhum imunossupressores. Todas as amostras dos pacientes foram obtidas com consentimento informado por escrito, e através de procedimentos aprovados pelo MGH e Shriners Conselhos de Revisão Institucional.
   1. Para a coleta de sangue de punção digital, lavar as mãos com água e sabão e seque a pele. Preparar a solução estoque anti-coagulant/stain adicionando 1 ml HBSS + 0,2% de HSA e 10 mL Hoechst mancha (32,4 mM) à heparina tubo de coleta de sangue (1,65 USP/50 mL de sangue). Picar o dedo usando uma lanceta segurança SurgiLance (profundidade de 2,2 mm, 22 G), limpe primeira gota de sangue e recolher 50 mL de sangue em tubo Eppendorf contendo o estoque de anti-coagulante e solução fluorescente mancha Hoechst (10 mL) e gentilmente misturar.
2. Incubar o sangue e Hoechst mancha durante 10 min para permitir a coloração fluorescente núcleo. Execute amostra dentro de 1 hora da coleta de sangue.

Neutrófilos humanos do sangue venoso

3. Desenhar 10 ml de sangue periférico, venoso em tubos contendo 33 USP de heparina.
4. Adicionar 50 mL de sangue venoso para a mídia e Hoechst mancha como descrito anteriormente. Incubar o sangue e Hoechst mancha durante 10 min para permitir a coloração fluorescente núcleo. Execute amostra dentro de 1 hora da coleta de sangue.

Neutrófilos Separação De Sangue - Controle Positivo

5. Para separar os neutrófilos, utilizar técnicas estéreis para isolar os neutrófilos a partir de 10 ml da amostra de sangue total venoso usando Hetastarch (6% w / v) de gradiente de densidade, seguido por uma selecção kit de isolamento de esfera magnética negativa seguindo o protocolo do fabricante.
6. Ressuspensas a alíquota final, de neutrófilos a uma concentrção de 4.000 células / ul em 1X HBSS + 0,2% de albumina do soro humano. Manter as células a 37 ° C até que esteja pronto para executar o experimento.

4. Microscopia e Análise de Imagem para medições de quimiotaxia de neutrófilos

1. Defina-se a temperatura biochamber a 37 ° C, humidade entre 80% e CO ₂ a 5%.
2. Comece imaginando imediatamente o uso de imagens de lapso de tempo em um microscópio (10X ou superior ampliação).

5. Statistical Analysis

1. Rastrear manualmente, pelo menos, 50 neutrófilos em cada amostra.
2. Contar as células que entram na FCC ao longo do tempo (Figura 2).
3. Calcular as velocidades de neutrófilos no canal entre WBLC e CCI, utilizando o ImageJ (NIH) (Figura 2).
4. Quantificar direccionalidade de neutrófilos através da contagem do número de células que passam a bifurcação e calcular a razão entre o número de células que voltam-se para o FCC e que as células de saída the dispositivo. As células que não são direcionais não seguem o gradiente quimiotático e, portanto, migrar em números iguais em direção à FCC e do canal de saída (Figura 2).

Resultados

O sangue (BM) ensaio quimiotaxia de neutrófilos todo foi validada medindo o acúmulo de neutrófilos para um gradiente fMLP (S1 Filme). Os resultados confirmam que os glóbulos vermelhos estão presos pelo pente filtração enquanto neutrófilos (azuis) são capazes de migrar ativamente de todo o sangue (Figura 3A e S1 Filme). O gradiente estável linear chemoattractant (verde), formado por todo o dispositivo micro sangue foi confirmado usando dextrano marcadas com FIT...

Discussão

Neste trabalho, foi desenvolvida uma plataforma microfluídica para medir quimiotaxia de neutrófilos a partir de uma gota de sangue (2 mL). A filtragem mecânica on-chip de hemácias de migração de neutrófilos ativamente contorna a necessidade de métodos complicados de separação de células, como a densidade gradientes ^10, a seleção positiva ^11, ou seleção negativa ^{de 12,} que são propensas a introduzir artefatos ativando neutrófilos. A filtragem mecânica de hemácias distin...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Fabrication
SU-8	Microchem	Y131273
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184 1.1 lb. Kit
Standard glass slides	Fisher Scientific	125495	1 X 3 inches
Glass-bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm	Ted Pella, Inc.	15081
Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm	Ted Pella, Inc.	15072
Microfluidic Assay Preparation and Analysis
Gel-loading pipet tip	Fisher Scientific	02-707-139
Syringe	Fisher Scientfic	309602
Blunt tip needle, 30 G ½ in.	Brico Medical Supply	BN3005
Vacutainer, Heparin	Becton Dickinson
HBSS	Sigma-Aldrich
Human serum albumin	Sigma-Aldrich	A5843-5G	0.2% final concentration in HBSS
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895-1MG
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G		SLN240
Hoescht stain	Life Technologies	H3570
Positive Control
HetaSep	STEMCELL Technologies Inc.	7906
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies Inc.	19257
Plasma Asher	March Instruments	P-250
Lindberg/Blue M Oven	Thermo Scientific	13-258-30C
Stainless Steel Precision Tweezers	Techni Tool	758TW458
Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator	Fisher Scientific	08-594-15A
Dataplate Digital Hot Plate	Alpha Multiservices	PMC 720
Nikon TiE inverted microscope	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MEA53100
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MRH20101
Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters	Chroma - Micro Video Instruments Inc.	31013v2
Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels	Qimaging - Micro Video Instruments Inc.	RET-2000R-F-M-12-C