פלטפורמת microfluidic למדידת נויטרופילים Chemotaxis מדם מלא לא מעובד

Summary

פרוטוקול זה מפרט assay נועד למדוד chemotaxis נויטרופילים אדם מטיפה אחת של דם מלא עם שחזור חזק. גישה זו עוקפת את הצורך בהפרדת נויטרופילים ודורשת זמן הכנת assay רק כמה דקות. שבב microfluidic מאפשר למדוד החוזרים ונשנים של chemotaxis נויטרופילים לאורך זמן בתינוקות או יונקים קטנים, שבו נפח דגימה מוגבל.

Abstract

נויטרופילים לשחק תפקיד חיוני בהגנה מפני זיהומים ומספרם בדם בתדירות גבוהה שנמדדו במרפאת. ספירת נויטרופילים גבוהה בדם הן בדרך כלל אינדיקטור של זיהומים מתמשכים, בעוד שספירת נויטרופילים נמוכה הן תמרור אזהרה לסיכון גבוה יותר לזיהומים. כדי להשיג את הפונקציות שלהם, נויטרופילים גם צריכים להיות מסוגל לנוע ביעילות מהדם שבו הם מבלים את רוב חייהם, לרקמות, שבו זיהומים להתרחש. כתוצאה מכך, פגמים ביכולת של נויטרופילים לנדוד יכולים להגדיל את הסיכונים לזיהומים, גם כאשר הנויטרופילים נוכחים במספרים מתאימים בדם. עם זאת, מדידת יכולת נדידת נויטרופילים במרפאת היא משימה מאתגרת, וזה זמן רב, דורש כמות גדולה של דם, ואת ידע של מומחה. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, עיצבנו מבחני microfluidic חזקים להגירת נויטרופילים, אשר דורש טיפה אחת של דם לא מעובד, נסיבותהפתחים את הצורך בהפרדת נויטרופילים, והוא קל לכמת על מיקרוסקופ פשוט. ב assay זה, נויטרופילים להעביר ישירות מטיפת הדם, בערוצים קטנים, לכיוון המקור של chemoattractant. כדי למנוע את הזרימה הפרטנית של תאי דם אדומים באמצעות אותם הערוצים, יישמנו מסננים מכאניים עם זווית נכונה הופך באופן סלקטיבי לחסום מראש של תאי דם אדומים. אנחנו תוקף את assay ידי השוואת נדידת נויטרופילים מטיפי דם שנאספו מדקירת אצבע ודם ורידים. אנחנו גם בהשוואה הדם כל אלה מקורות (WB) בנדידת נויטרופילים מדגימות של נויטרופילים המטוהרים ומצאנו במהירות עקבית ויווניות בין שלושה המקורות. פלטפורמת microfluidic זה תאפשר חקר נדידת נויטרופילים אנושי במרפאת והגדרת המחקר כדי לעזור לקדם את ההבנה של פונקציות נויטרופילים בבריאות ובחוליים שלנו.

Introduction

סחר נויטרופילים משחק תפקיד קריטי בקביעת ההתקדמות והרזולוציה של רבים מצבים דלקתיים, כוללים טרשת עורקים ^1, זיהום חיידקים או אלח דם ^2, ולשרוף פציעה ^3. על התרומה הגדולה שלהם למצבים בריאותיים ומחלות, ספירת נויטרופילים היא חלק מבדיקות הדם הסטנדרטי נחשבות לעתים קרובות במעבדות קליניות ומחקר. עם זאת, למרות היותו אחד המבחנים הנפוצים ביותר, את הערך של ספירת נויטרופילים באבחנה של זיהום ואלח דם נחקר בתדירות גבוהה ^4. לדוגמא, מחקר אחד של נויטרופילים בחולי כווייה גילה כי ספירת נויטרופילים ותפקוד הגירת נויטרופילים לא לתאם; המסמנים נויטרופילים כי לספור לבדו אינו אינדיקציה מדויקת של מצב חיסוניים ^3. אמנם קשה יותר למדידה, יכולת התפקודית נויטרופילים הוצעה כבעל ערך רב יותר במגוון רחב של תנאים.

t "> חשוב לציין, שרבים מפגמי נויטרופילים הם ארעיים ואינם מופעלים על ידי פגמים גנטיים קבועים, הבחנה שהתעלמה במידה רבה במרפאת עד לאחרונה. בהקשר של פציעות לשרוף, הגירת נויטרופילים יכולה להיות במעקב במהלך הטיפול של חולה כמדד למצב דלקתי או זיהום ^3. מבחני הגירה מסורתיים המשמשים כיום במעבדה (קאמרי בוידן, קאמרי דאן, assay micropipette) לא יכול להיות מתורגם להגדרה קלינית כי הם דורשים כמויות גדולות של דם ומסורבל זמן רב טכניקות בידוד נויטרופילים (טבלה 1). מבחני אלה גם לא יכולים להשתמש בהם כדי לעקוב אחר שינויים חולפים בchemotaxis נויטרופילים בחיות מעבדה קטנות, כגון עכברים, כי נפח דם הדרוש לבידוד נויטרופילים מאפשר רק דגימה אחת, ולעתים קרובות אפילו דורש איגום דם מחיות מרובות עבור assay אחד. למשל, מ 'מחקר מעורבתנאי ultiple וטיפולים לאורך זמן, מספר רב של נקודות עלולים לדרוש אלפי עכברים באמצעות מבחני chemotaxis הנוכחיים. זה מגביל את המחקר הביולוגי הבסיסי שניתן לעשות כדי להבין את הדינמיקה המורכבת של תפקוד מערכת החיסון בהקשר של פציעה, זיהום או לצרוב לעתים קרובות למדו במודלים העכבריים ^5.

כדי לענות על הצורך לassay הפונקציונלי נויטרופילים כי הוא מהיר, חזק, תוך דרישה מינימאלי נפח דם, שפיתחנו מכשיר microfluidic המודד chemotaxis נויטרופילים ישירות מטיפה קטנה של דם מלא. זה ידוע כי גורמים רבים בדם כולו, כוללים בסרום ⁶ וטסיות דם ^7, להשפיע על תפקוד נויטרופילים. לכן זה מועיל שכל assay microfluidic הדם ממזער עיבוד מדגם לשמור microenvironment vivo של נויטרופילים כאשר מודד שינויים בchemotaxis עם assay במבחנה ^8. גישה זומפחית את הזמן מאיסוף דם למבחני הגירת נויטרופילים משעות תוך שימוש בטכניקות מסורתיות, לדקות ספורות (טבלה 1). פלטפורמת microfluidic הדם כולו מייצרת שיפוע chemoattractant יניארי יציב לאורכו של הניסוי, אין לו חלקים נעים, ואינה דורשת מקור לחץ חיצוני (משאבת מזרק כלומר). תכונת מפתח בעיצוב של מכשיר microfluidic הדם השלם היא שילוב של תאי דם אדומים מסרק סינון (RBC) כי מכאני מסנני RBCs מלהיכנס לערוץ ההגירה של המכשיר. הפניות ימינה של מסרק סינון זה למנוע את הצורך בסינון הרחקת גודל, שעשוי להיות סתום על ידי תאי דם אדומים ולכן לחסום את שיפוע chemoattractant מלהגיע נויטרופילים פעיל הנודדים בWB. השילוב של מכשיר microfluidic הדם כולו בצלחת 12 או 24 גם מאפשר ההקרנה של מתווכים מרובים של si chemotaxis נויטרופילים אדם או העכבריmultaneously.

Protocol

1. ייצור מכשיר microfluidic

1. באמצעות שימוש בטכניקות photolithographic סטנדרטיים, לפברק רקיק עובש האב בחדר נקי ברמה 1,000. תבנית השכבה הראשונה 3 מיקרומטר הדק מבוסס אפוקסי השלילית photoresist להגדיר ערוצי הגירה על פי ההוראות של היצרן. תבנית השכבה 50 מיקרומטר בעובי השנייה כדי להגדיר את תאי תאי העמסה וchemokine.
2. השתמש בדוגמת הוופל להטיל polydimethylsiloxane מכשירים (PDMS). במרץ לערבב PDMS (20 ז) עם יוזם (2 גר ') למשך 5 דקות באמצעות מזלג פלסטיק במגש פלסטיק גדול במשקל.
3. יוצק PDMS בזהירות על תבנית.
4. דגה PDMS על ידי הצבת תבנית עם PDMS שפכו בייבוש ואקום במשך שעה 1.
5. לאפות ולרפא מכשירי microfluidic PDMS במשך לפחות 3 שעות בתנור ב65 ° C.
6. אגרוף החוצה WBLCs המרכזי באמצעות אגרופן בקוטר קצה 1.5 מ"מ.
7. אגרוף החוצה התקנים בצורת סופגנייה שלמים באמצעות puncשלה בקוטר קצה 5.0 מ"מ.
8. להסיר חלקיקים מהתקני סופגנייה באמצעות נייר דבק.
9. יש לשטוף את צלחת 12 היטב עם מים deionized ולאחר מכן יבש עם חנקן. מניחים צלחת בתנור 60 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
10. פלזמה חמצן טיפול 12 גם הצלחת פעמיים; פעם אחת בלבד ל35 שניות ולאחר מכן שוב עם מכשירי סופגנייה לעוד שניות 35.
11. למקם את המכשירים בזהירות בבארות של הצלחת באמצעות פינצטה.
12. צלחת אופים עם התקני ערובה על פלטה חשמלית מוגדרת 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

2. Microfluidic Assay הכנה

1. מכשירי microfluidic ראש מייד לאחר טיפול פלזמה החמצן, כאשר המכשיר הוא הידרופילי ואפקטי נימים יכולים לקדם תחול מהערוצים הקטנים במכשיר.
2. יצירת פתרון chemoattractant על ידי ערבוב 5 μl fMLP [פתרון מניות 10 מיקרומטר] עם 5 μl פיברונקטין [מ"ג פתרון מניות 1 / מיליליטר] ו490 μl HBSS.
3. pipet & # לאט160; פתרון chemoattractant לWBLC, באמצעות קצה טעינת ג'ל (איור 1 א). Pipet 20 μl נוסף של chemoattractant סביב החלק החיצוני של המכשיר.
4. מניחים צלחת בתוך תא ייבוש במשך 15 דקות. על ידי יישום ואקום למכשיר, הפתרון הוא החדיר לתוך תופעות הערוצים של המכשיר ואת האוויר שנעקר מתפזר החוצה דרך PDMS.
5. הסר את הצלחת מהייבוש ולאשר הרטבה של ערוץ מכשיר תחת מיקרוסקופ. שהעונים כמו בועה הופכת להיות קטנה יותר כפתרון chemoattractant נכנס לחדר. אין בועה צריכה להיות נוכחת בתוך המכשיר לאחר טיפול ואקום.
6. שטוף את WBLC וחיצוני של המכשיר ביסודיות כדי להסיר פתרון chemoattractant עודף. צעד זה יוצר שיפוע של chemoattractant מכל אחד מתאי מוקד chemotactic (FCCs) למרכז המכשיר.
   1. ממלאי מזרק 1 מ"ל עם PBS, להוסיף קצה מחט בוטה 30 G למזרק. בעדינות, הכנס את קצה המחט של המזרק בלמרכז חור הסופגנייה. דחף בעדינות של PBS 100 μl לתוך החור כך שאגל של צורות PBS על גבי המכשיר.
   2. מיליליטר צלחת הטיה ופיפטה 1 של PBS סביב מכשיר, כך שהנוזל אוסף בתחתית הבאר. לשאוב את התהליך הנוזלי וחזור לסך של 3x באמצעות פתרון חיץ טרי (מדיה שימוש במקום חיץ אם יהיו טעונות נויטרופילים המופרדים בתקשורת) ^9.
7. ממלא כל היטב עם תקשורת עד לצמרות של המכשירים הן שקועות מתחת לנוזל. בואו ההתקנים לשבת במשך 15 דקות, כדי לאפשר שיפוע להתייצב. תוצאות ניסוי ונתונים תיאורטיים מסימולציות אלמנטים סופיות מראים כי ההדרגות במכשירים אלה הן יציבים עד 24 שעות למולקולות קטנות (לדוגמא, fMLP) ועד לכמה ימים למשקל גדול יותר מולקולרי (למשל, IL8).
8. בעזרת טיפים טעינת ג'ל, פיפטה לאט 2 μl של דם (או נויטרופילים בודדים) לכל אחד לואה דם כלדינג קאמרי (איור 1 א) (WBLC).

3. לדוגמא הכנה

נויטרופילים אנושיים מנימי דם

1. איסוף דם נימים מדקירת אצבעו של מתנדב בריא, שהוא בשום דיכוי חיסוני. כל דגימות החולה התקבלו עם כתב הסכמה מדעת, ובאמצעות נהלים שאושרו על ידי MGH ושריינרים לוחות סקירה מוסדי.
   1. לאיסוף דם זין אצבע, לשטוף את הידיים במים וסבון ולייבש את העור. הכן את פתרון מניות anti-coagulant/stain על ידי הוספת 1 מיליליטר HBSS + 0.2% HSA ו10 כתם Hoechst μl (32.4 מיקרומטר) להפרין צינור איסוף דם (1.65 USP/50 דם μl). דקור את האצבע באמצעות Lancet בטיחות SurgiLance (עומק 2.2 מ"מ, 22 G), לנגב טיפת דם ראשונה ולאסוף 50 μl של דם בצינור Eppendorf המכיל נוגדת קרישת המניה ופתרון Hoechst כתם ניאון (10 μl) ובעדינות לערבב.
2. דגירה הדם וכתם Hoechst ל10 דקות, כדי לאפשר לצביעת ניאון גרעין. הפעל מדגם בתוך 1 שעות של איסוף דם.

נויטרופילים אנושיים מהדם ורידים

3. צייר 10 מיליליטר של דם היקפי, ורידים לתוך צינורות המכילים 33 USP הפרין.
4. הוסף 50 μl של דם ורידים לתקשורת וכתם Hoechst כפי שתואר לעיל. דגירה הדם וכתם Hoechst ל10 דקות, כדי לאפשר לצביעת ניאון גרעין. הפעל מדגם בתוך 1 שעות של איסוף דם.

הפרדת נויטרופילים מן הדם כל - בקרה חיובית

5. להפריד נויטרופילים, השתמש בטכניקות סטריליות לבודד את הנויטרופילים מן מדגם 10 מיליליטר ורידי דם כל שימוש Hetastarch (6% w / v) שיפוע צפיפות ואחריו ערכה שלילית בחירת חרוז מגנטי בידוד בעקבות פרוטוקול היצרנים.
6. Resuspended aliquot הסופי של נויטרופילים בconcentrע 4,000 תאים / μl בHBSS + 0.2% אלבומין בסרום אדם 1X. שמור את התאים על 37 מעלות צלזיוס עד מוכן להפעיל את הניסוי.

4. מיקרוסקופית וניתוח תמונה למדידות נויטרופילים Chemotaxis

1. הגדר את טמפרטורת biochamber 37 ° C, לחות ב80%, ו-CO ₂ של 5%.
2. להתחיל באופן מיידי באמצעות הדמיה הזמן לשגות הדמיה על מיקרוסקופ (10X או הגדלה גבוהה יותר).

5. ניתוח סטטיסטי

1. ידני לעקוב אחר לפחות 50 הנויטרופילים במדגם זה.
2. ספירת תאי הזנת ה-FCC לאורך זמן (איור 2).
3. חישוב מהירויות נויטרופילים בערוץ בין WBLC וFCC באמצעות ImageJ (NIH) (איור 2).
4. לכמת יווניות של נויטרופילים על ידי ספירת מספר התאים שעוברים הסתעפות וחישוב היחס בין מספר התאים הפונים לכיוון ה-FCC ותאי שהיציאה הדואר מכשיר. תאים שאינם כיוונית לא פעלו שיפוע chemotactic ולכן נודדים במספרים שווים לכיוון ה-FCC וערוץ היציאה (איור 2).

תוצאות

Assay chemotaxis נויטרופילים דם (WB) השלם היה תוקף על ידי מדידת ההצטברות של נויטרופילים לכיוון שיפוע fMLP (סרט S1). תוצאות מאשרות כי RBCs לכודים על ידי מסרק הסינון תוך נויטרופילים (כחול) יכולים להגר באופן פעיל מתוך כל הדם (איור 3 א והסרט S1). השיפוע היציב ליניארי chemoattr...

Discussion

בעבודה זו, שפיתחנו פלטפורמת microfluidic למדוד chemotaxis נויטרופילים מטיפה של דם (2 μl). הסינון המכני על השבב של תאי דם אדום מפעיל נודדים נויטרופילים עוקף את הצורך בשיטות מסורבלות הפרדת תא כגון צפיפות הדרגתיים ^10, סלקציה חיובית ^11, או סלקציה שלילית ^12, אשר נוטות לה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Fabrication
SU-8	Microchem	Y131273
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184 1.1 lb. Kit
Standard glass slides	Fisher Scientific	125495	1 X 3 inches
Glass-bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm	Ted Pella, Inc.	15081
Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm	Ted Pella, Inc.	15072
Microfluidic Assay Preparation and Analysis
Gel-loading pipet tip	Fisher Scientific	02-707-139
Syringe	Fisher Scientfic	309602
Blunt tip needle, 30 G ½ in.	Brico Medical Supply	BN3005
Vacutainer, Heparin	Becton Dickinson
HBSS	Sigma-Aldrich
Human serum albumin	Sigma-Aldrich	A5843-5G	0.2% final concentration in HBSS
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895-1MG
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G		SLN240
Hoescht stain	Life Technologies	H3570
Positive Control
HetaSep	STEMCELL Technologies Inc.	7906
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies Inc.	19257
Plasma Asher	March Instruments	P-250
Lindberg/Blue M Oven	Thermo Scientific	13-258-30C
Stainless Steel Precision Tweezers	Techni Tool	758TW458
Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator	Fisher Scientific	08-594-15A
Dataplate Digital Hot Plate	Alpha Multiservices	PMC 720
Nikon TiE inverted microscope	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MEA53100
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MRH20101
Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters	Chroma - Micro Video Instruments Inc.	31013v2
Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels	Qimaging - Micro Video Instruments Inc.	RET-2000R-F-M-12-C