未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム

要約

このプロトコルは、堅牢で再現性の全血の1滴からヒト好中球走化性を測定するように設計分析について詳しく説明します。このアプローチは、好中球の分離のための必要性を回避し、アッセイ準備時間のほんの数分を要する。サンプル量が限られているマイクロ流体チップは、乳幼児や小さな哺乳類では時間の経過とともに好中球走化性の反復測定を可能にします。

要約

好中球は、感染および血液中のそれらの数に対する保護において重要な役割を果たして頻繁に診療所で測定される。低好中球数は感染症の高いリスクについて警告サインであるが、血液中の高い好中球数は、通常、進行中の感染症の指標である。その機能を達成するために、好中球はまた、感染症が発生する組織内に、彼らの人生の大半を費やし、血液から効果的に移動できるようにする必要がある。その結果、移行する好中球の能力の欠陥は、好中球は、血液中の適切な数で存在する場合にも、感染症のリスクを高めることができます。しかし、診療所での好中球の遊走能を測定することは、時間がかかり、困難な作業であり、多量の血液、及び専門的な知識が必要になります。これらの制限に対処するために、我々はまわり、未処理の血液の一滴を必要とする好中球遊走のためのロバストなマイクロ流体アッセイを設計した好中球の分離の必要性を通気し、簡単な顕微鏡で定量化することは容易である。このアッセイでは、好中球は、化学誘引物質源に向かって、小さなチャネルを通して、血液の液滴から直接移行します。同じチャネルを介して赤血球の粒状流れを防止するために、我々は、選択的に赤血球の進行をブロックすることになり直角と機械的にフィルタを実装した。我々は、指穿刺および静脈血から採取された血液の液滴からの好中球遊走を比較することによりアッセイを検証した。我々はまた、精製された好中球のサンプルから好中球の遊走これらの全血（WB）のソースを比較し、3ソース間の一貫性の速度と方向性を見つけた。このマイクロ流体プラットフォームは、健康と病気における好中球機能の理解を進めるために役立つクリニックや研究環境で、人間の好中球遊走の研究が可能になります。

概要

好中球の人身売買は、アテローム性動脈硬化症^1、細菌感染症や敗血症²を含む多くの炎症状態の進行と解像度を決定する上で重要な役割を果たしており、傷害^3を焼く。健康と病気の状態への主要な貢献のために、好中球数は、多くの場合、臨床および研究実験室で検討標準的な血液分析の一部である。しかし、ほとんどのユビキタス試験の一つであるにも関わらず、感染症や敗血症の診断における好中球数の値が頻繁に^4を疑問視されている。例えば、熱傷患者における好中球の1の研究では、好中球数及び好中球遊走機能は相関しないことを明らかにした。好中球が単独で数えることを意味して免疫状態³の正確な指標ではありません。測定することはより困難であるが、好中球の機能的能力は、広範囲の条件でより価値として提案されている。

tは ">重要なのは、好中球の欠陥の多くは一過性であり、恒久的な遺伝的欠陥によってトリガされず、大部分は最近まで、診療所で見過ごされてきた区別は。火傷の文脈では、好中球遊走はもちろん中に監視することができた炎症状態または感染³の指標として、患者の治療が、彼 ​​らは大量の血液を必要とするため、現在の研究室（Boydenチャンバー、ダン室、マイクロピペットアッセイ）で使用される従来の移動アッセイは、臨床現場に翻訳することができず、面倒で時間のかかる好中球の単離技術（ 表1）。好中球の単離のために必要な血液の量は、一つのサンプルのみを可能にし、多くの場合、偶数のプーリングを必要とするため、これらのアッセイはまた、マウスなどの実験小動物における好中球走化性の過渡的変化を監視するために使用することができない単一のアッセイのための複数の動物から血液が、例えば、関係する研究では、M複数の時点にわたるultiple条件や治療は、潜在的に、現在の走化性アッセイを用いて、マウスの数千を必要とする可能性があります。これは、損傷、感染症との関連で、免疫機能の複雑な力学を理解したり、多くの場合、マウスモデル⁵で研究を燃やすために行うことができる基本的な生物学的研究を制限します。

最小限の血液量を必要としながら、迅速なロバストである好中球機能アッセイの必要性に対処するために、我々は、全血の小滴から直接好中球走化性を測定するマイクロ流体デバイスを開発した。これは、血清⁶および⁷を含む血小板を全血には多くの要因が、好中球機能に影響を与えることが知られている。なお、全血のマイクロ流体アッセイはin vitroアッセイで⁸走化性における変化を測定するとき、好中球のインビボでの微小環境を維持するために、試料の処理を最小限に抑えることが有益である。このアプローチわずか数分（ 表1）に、従来の技術を用いて時間で好中球遊走アッセイに採血からの時間を低減する。全血のマイクロ流体プラットフォームは、実験期間のための安定した直線的誘引物質勾配を生成し、可動部品がなく、外部の圧力源（ すなわちシリンジポンプ）を必要としない。全血のマイクロ流体デバイスの設計における重要な特徴は、機械装置の移動路に入るのRBCをフィルタリングする赤血球（RBC）を濾過コムの組み込みである。このろ過櫛の右ターンはおそらく赤血球で詰まることになるサイズ排除濾過の必要性を防ぐため、WBに積極的に移行し、好中球に到達する化学誘引物質勾配を遮断する。 12または24ウェルプレート中の全血のマイクロ流体装置の組み込みは、ヒトまたはマウスの好中球走化性siを複数のメディエーターのスクリーニングを容易にする同時進行。

プロトコル

1。マイクロ流体デバイスの作製

1. 標準的なフォトリソグラフィ技術を使用して、クラス千クリーンルーム内でマスターモールドウェハを作製。パターン製造業者の指示に従って、移行チャネルを定義するための第3μmの薄いエポキシベースのネガ型フォトレジスト層を形成する。パターンセルローディングおよびケモカイン室を定義する第50μmの厚さの層。
2. ポリジメチルシロキサン（PDMS）デバイスをキャストするようにパターン化ウェハを使用しています。激しく大きなプラスチック秤量トレイのプラスチックフォークを用いて5分間、開始剤（2g）を用いてPDMS（20g）に混合する。
3. 慎重に、金型上に、PDMSを注ぐ。
4. 1時間真空乾燥器にあけ、PDMS金型を配置することによって、PDMSを脱気。
5. 焼くと65℃に設定したオーブンで、少なくとも3時間、PDMSマイクロ流体デバイスを治す
6. 1.5ミリメートルの先端径とパンチャーを使用して中央WBLCsを打ち抜く。
7. 穿刺を用いて全ドーナツ型のデバイスをパンチアウト5.0ミリメートルの先端径と彼女。
8. 粘着テープを使用したドーナツデバイスから粒子を除去する。
9. 脱イオン水で12ウェルプレートを洗い流してから窒素で乾燥。 5分間60℃のオーブンにプレートを置きます。
10. 酸素プラズマは、二回の12ウェルプレートを治療する;一回だけでは35秒してから、再度、別の35秒間のドーナツデバイスと。
11. 慎重にピンセットを用いてプレートのウェル内のデバイスを配置します。
12. 10分間80℃に設定したホットプレート上に結合したデバイスとのベークプレート。

2。マイクロ流体アッセイの準備

1. 直ちに酸素プラズマ処理後の素数マイクロ流体デバイスは、デバイスは、親水性及び毛細管効果がある場合、デバイスの小さなチャネルのプライミングを促進することができる。
2. 5μLフィブロネクチン[原液を1 mg / mlの]と490μlのHBSSで5μLのfMLP [原液を10μm]を混合して化学誘引ソリューションを作成します。
3. ゆっくりとピペット＆＃160; WBLCに化学誘引物質溶液、ゲルローディングチップ（ 図1A）を使用して。ピペット装置の外部の周りの化学誘引物質の追加の20μL。
4. 15分間デシケーター中でプレートを置きます。装置に真空を適用することにより、溶液を装置及びPDMSを通って拡散される空気のサイドチャネルに注入される。
5. デシケーターからプレートを取り外し、顕微鏡下でデバイスチャネルの濡れ性を確認。化学誘引物質溶液がチャンバに入ると、気泡が小さくなるように見る。気泡は、真空処理後のデバイス内に存在してはならない。
6. 徹底的に余分な化学誘引物質溶液を除去するための装置のWBLCと外側を洗ってください。このステップは、デバイスセンターに焦点走化性チャンバー（FCCの）のそれぞれから誘引物質の勾配を発生させる。
   1. シリンジに30Gの鈍針の先端を追加し、PBSで1 mLの注射器を埋める。優しく、シリンジの針の先端を挿入ドーナツ穴の中心。そっと穴に100μlのPBSをプッシュするようにデバイス上部のPBS形の滴。
   2. 傾斜プレートピペット装置の周りのPBS 1mlの液体がウェルの底に集まるようにする。吸引除去新鮮な緩衝液を用いて3倍の合計のために液体を繰り返しプロセス（代わりにバッファの使用メディア分離好中球がメディアにロードされる場合^）9。
7. デバイスの上部に液体の下に沈むまで、メディアと各ウェルを埋める。デバイスは、勾配が安定するまで15分間放置します。実験結果と有限要素シミュレーションから理論的なデータは、これらのデバイス内の勾配は小分子（ 例えば 、fMLPで）のために、より大きな分子量（ 例えば 、IL-8）のためのいくつかの日まで24時間まで安定であることを示している。
8. ゲルローディングチップを使用して、徐々に各々の全血LOAに2血液の液（または単離された好中球）をピペット丁室（WBLC）（ 図1A）。

3。サンプルの調製

毛細血管血液からヒト好中球

1. 無免疫抑制剤である健康なボランティアの指を刺すから毛細管血を収集します。すべての患者のサンプルは、書面によるインフォームドコンセントを得て、MGHとシュライナー治験審査会によって承認された手順を経て行った。
   1. 指穿刺採血のために、水と石鹸で手を洗い、皮膚を乾燥させます。採血管（1.65 USP/50μlの血液）をヘパリンに1ミリリットルのHBSS +0.2％HSAおよび10μlのヘキスト染色（32.4μM）を添加することによりanti-coagulant/stainストック溶液を準備します。優しく、SurgiLance安全ランセット（2.2 mmの深さ、22）を用いた指を刺し血液の最初の一滴を払拭し、株式抗凝固剤およびヘキスト蛍光染色溶液（10μl）を含むエッペンドルフチュー​​ブ内の血液の50μLを収集し、混ぜる。
2. 核蛍光染色を可能にするために10分間の血とヘキスト染色をインキュベートする。採血の1時間以内にサンプルを実行します。

静脈血から、ヒト好中球

3. 33 USPヘパリンを含む試験管に末梢静脈血の10ミリリットルを描画します。
4. 前述したように、メディアとヘキスト染色に静脈血50μlを加える。核蛍光染色を可能にするために10分間の血とヘキスト染色をインキュベートする。採血の1時間以内にサンプルを実行します。

全血からの好中球の分離 - ポジティブコントロール

5. 好中球を分離ヘタスターチを用いて10ミリリットル静脈全血サンプルから好中球を単離するために、無菌技術を使用する（6％w / v）の製造業者のプロトコールに従ってネガティブ選択磁気ビーズ単離キット、続いて密度勾配。
6. concentrで好中球の最終的な分量を再懸濁1X HBSS +0.2％ヒト血清アルブミン/μL4000細胞のATION。実験を実行する準備が整うまで、37℃で細胞を維持する。

好中球走化性測定用4。顕微鏡と画像解析

1. 5％、37℃、80％の湿度、およびCO ₂へのバイオチャンバーの温度を設定します。
2. 顕微鏡（10倍以上の倍率）でタイムラプスイメージングを使用して、すぐに撮像立。

5。統計解析

1. 手動で各試料中の少なくとも50の好中球を追跡します。
2. 時間をかけて、FCCに入る細胞（ 図2）を数える。
3. ImageJの（NIH）（ 図2）を使用してWBLCおよびFCC間のチャネルにおける好中球の速度を計算します。
4. 分岐部を通過する細胞の数を計数し、終了番目FCC細胞に向かって回す細胞の数との比を計算することによって好中球の指向性を定量化する電子装置。方向性のないセルは、走化性勾配に従うため、FCCおよび出口チャネル（ 図2）に向けて同数に移行されません。

結果

全血（WB）好中球走化性アッセイは、fMLPの勾配（ 映画S1）に向かう好中球の蓄積を測定することにより確認した。結果は、好中球（ブルー）が積極的に全血（ 図3Aと動画S1）から移動することができますが赤血球を濾過コームにトラップされていることを確認。全血のマイクロ流体装置によって形成された安定な化学誘引物質線形勾配（緑色）は、FITC-標...

ディスカッション

本研究では、血液の小滴（2μL）から好中球の走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォームを開発しました。積極的に好中球の移行からのRBCのオンチップ·機械的ろ過は、好中球を活性化することにより、成果物を導入する傾向があるような密度が^10の勾配などの煩雑な細胞分離方法は、ポジティブ選択^11、または負の選択¹²の必要性を回避する。 RBCの機械的...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Fabrication
SU-8	Microchem	Y131273
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184 1.1 lb. Kit
Standard glass slides	Fisher Scientific	125495	1 X 3 inches
Glass-bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm	Ted Pella, Inc.	15081
Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm	Ted Pella, Inc.	15072
Microfluidic Assay Preparation and Analysis
Gel-loading pipet tip	Fisher Scientific	02-707-139
Syringe	Fisher Scientfic	309602
Blunt tip needle, 30 G ½ in.	Brico Medical Supply	BN3005
Vacutainer, Heparin	Becton Dickinson
HBSS	Sigma-Aldrich
Human serum albumin	Sigma-Aldrich	A5843-5G	0.2% final concentration in HBSS
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895-1MG
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G		SLN240
Hoescht stain	Life Technologies	H3570
Positive Control
HetaSep	STEMCELL Technologies Inc.	7906
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies Inc.	19257
Plasma Asher	March Instruments	P-250
Lindberg/Blue M Oven	Thermo Scientific	13-258-30C
Stainless Steel Precision Tweezers	Techni Tool	758TW458
Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator	Fisher Scientific	08-594-15A
Dataplate Digital Hot Plate	Alpha Multiservices	PMC 720
Nikon TiE inverted microscope	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MEA53100
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MRH20101
Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters	Chroma - Micro Video Instruments Inc.	31013v2
Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels	Qimaging - Micro Video Instruments Inc.	RET-2000R-F-M-12-C