Plate-forme microfluidique pour mesurer la chimiotaxie des neutrophiles du sang entier non transformé

Résumé

Ce protocole détaille un test destiné à mesurer la chimiotaxie des neutrophiles humaine d'une gouttelette de sang total avec une reproductibilité robuste. Cette approche évite la nécessité d'une séparation des neutrophiles et ne nécessite que quelques minutes de test de temps de préparation. La puce microfluidique permet la mesure répétée de la chimiotaxie des neutrophiles au fil du temps chez les nourrissons ou les petits mammifères, où le volume de l'échantillon est limité.

Résumé

Les neutrophiles jouent un rôle essentiel dans la protection contre les infections et leur nombre dans le sang sont souvent mesurés à la clinique. Le nombre de neutrophiles plus élevés dans le sang sont généralement un indicateur des infections en cours, tandis que faible numération des neutrophiles sont un signe d'alerte pour des risques plus élevés pour les infections. Pour accomplir leurs fonctions, les neutrophiles doivent également être en mesure de se déplacer efficacement dans le sang où ils passent la plupart de leur vie, dans les tissus, où les infections se produisent. Par conséquent, tous les défauts de la capacité des neutrophiles de migrer peuvent augmenter les risques d'infections, même lorsque les neutrophiles sont présents en nombre suffisant dans le sang. Toutefois, la mesure de la capacité de migration des neutrophiles dans la clinique est une tâche difficile, qui prend du temps, nécessite volume important de sang, et les connaissances d'experts. Pour répondre à ces limitations, nous avons conçu un solide tests microfluidiques pour la migration des neutrophiles, qui nécessite une seule goutte de sang non traité, circumévents la nécessité d'une séparation des neutrophiles, et est facile à quantifier sur un simple microscope. Dans ce dosage, les neutrophiles migrent directement à partir de la goutte de sang, à travers de petits canaux, vers la source de chimio-attractif. Pour éviter que le flux granulaire de globules rouges par la même voie, nous avons mis filtres mécaniques avec des virages à angle droit qui bloquent sélectivement l'avance de globules rouges. Nous avons validé le test en comparant la migration des neutrophiles de gouttelettes de sang prélevés de piqûre au doigt et le sang veineux. Nous avons également comparé les sang total (WB) sources de la migration des neutrophiles à partir d'échantillons de neutrophiles purifiés et trouvé une vitesse constante et la directionnalité entre les trois sources. Cette plate-forme microfluidique permettra l'étude de la migration des neutrophiles humain dans la clinique et le contexte de la recherche pour faire avancer notre compréhension des fonctions des neutrophiles dans la santé et la maladie.

Introduction

trafic de neutrophiles joue un rôle déterminant dans l'évolution et la résolution de nombreuses affections inflammatoires, y compris l'athérosclérose ^1, infection bactérienne ou une septicémie ^2, et ³ de brûlures. Pour leur importante contribution à des conditions de santé et de maladie, le nombre de neutrophiles est partie de l'analyse de sang norme souvent considéré dans les laboratoires cliniques et de recherche. Toutefois, en dépit d'être l'un des tests les plus répandus, la valeur de la numération des neutrophiles dans le diagnostic de l'infection et de septicémie a été souvent interrogé ^4. Par exemple, une étude de neutrophiles chez les patients atteints de brûlures a révélé que le nombre de neutrophiles et la fonction de la migration des neutrophiles ne concordent pas; ce qui signifie que nombre de neutrophiles seul n'est pas un indicateur précis de l'état immunitaire ^3. Bien que plus difficile à mesurer, la compétence fonctionnelle des neutrophiles a été proposée comme plus précieuse dans un large éventail de conditions.

t "> Surtout, la plupart des défauts de neutrophiles sont transitoires et ne sont pas déclenché par des anomalies génétiques permanents, une distinction qui a été largement négligé dans la clinique jusqu'à récemment. Dans le cadre de brûlure, la migration des neutrophiles pourrait être surveillée au cours de le traitement d'un patient comme un indicateur de l'état inflammatoire ou une infection ^3. tests traditionnels de migration actuellement utilisés dans le laboratoire (chambre de Boyden, chambre Dunn, micropipette essai) ne peut pas être traduite dans un cadre clinique, car ils nécessitent de grandes quantités de sang et encombrant temps Des techniques d'isolation des neutrophiles (tableau 1). Ces dosages peuvent également pas être utilisés pour surveiller des changements transitoires de la chimiotaxie des neutrophiles chez les petits animaux de laboratoire, tels que les souris, parce que le volume de sang nécessaire pour l'isolement des neutrophiles permet un seul échantillon, et souvent même exige la mise en commun d' le sang de plusieurs animaux pour un seul essai. Par exemple, une étude portant sur mconditions ultiple et des traitements sur plusieurs points dans le temps pourraient exiger des milliers de souris en utilisant des tests de chimiotactisme actuelles. Cela limite la recherche biologique de base qui peut être fait pour comprendre la dynamique complexe de la fonction immunitaire dans le cadre de blessure, une infection ou brûler souvent étudiée dans les modèles murins ^5.

Pour répondre à la nécessité d'un dosage fonctionnel des neutrophiles qui est rapide et robuste, tout en nécessitant un minimum de volume de sang, nous avons développé un dispositif microfluidique qui mesure directement la chimiotaxie des neutrophiles à partir d'une petite gouttelette de sang total. Il est connu que de nombreux facteurs dans le sang total, le sérum, y compris les plaquettes ⁶ et ^7, affectent la fonction des neutrophiles. Il est donc avantageux que l'ensemble de dosage microfluidique de sang réduit au minimum le traitement des échantillons pour maintenir le micro-environnement in vivo de la neutrophiles lors de la mesure des variations de la chimiotaxie avec un essai in vitro ^8. Cette approcheréduit le temps de collecte de sang pour des tests de migration des neutrophiles provenant heures en utilisant des techniques classiques, à quelques minutes (tableau 1). L'ensemble de la plate-forme de micro-fluidique de sang produit un gradient chimiotactique linéaire stable pour la durée de l'expérience, n'a pas de parties mobiles, et ne nécessite pas une source de pression externe (par exemple de la pompe à seringue). La caractéristique clé de la conception de l'ensemble du dispositif de microfluidique sanguin est l'incorporation d'un globule rouge (RBC) de peigne de filtration qui filtre mécaniquement les globules rouges de pénétrer dans le canal de migration du dispositif. Les virages à droite de ce peigne de filtration empêchent la nécessité pour la filtration d'exclusion de taille, qui serait susceptible d'être bouché par les globules rouges et donc bloquent le gradient chimiotactique d'atteindre les neutrophiles migrent activement à la Banque mondiale. L'incorporation de l'ensemble du dispositif de microfluidique de sang dans une plaque à 12 ou 24 puits facilite le criblage de multiples médiateurs de la chimiotaxie des neutrophiles si humaine ou murinemultanément.

Protocole

1. Microfluidique fabrication de périphériques

1. En utilisant des techniques de photolithographie standard fabriquer le moule maître plaquette dans une salle blanche de classe 1000. Motif du premier 3-um-mince couche de résine photosensible négative à base d'époxy pour définir les voies de migration selon les instructions du fabricant. Motif de la deuxième couche de 50 um d'épaisseur pour définir les cellules de chargement et de chimiokines chambres.
2. Utilisez la plaquette motifs de jeter polydiméthylsiloxane appareils (PDMS). Mélanger vigoureusement PDMS (20 g) avec un initiateur (2 g) pendant 5 minutes en utilisant une fourchette en plastique dans un grand plateau de pesée en plastique.
3. Versez délicatement PDMS sur moule.
4. Dégazer le moule en plaçant PDMS avec PDMS coulé dans un dessiccateur sous vide pendant 1 heure.
5. Cuire au four et guérir dispositifs microfluidiques PDMS pendant au moins 3 heures dans un four réglé à 65 ° C.
6. Percez les WBLCs centrales utilisant un perforateur avec un diamètre de 1,5 mm de pointe.
7. Punch out dispositifs en forme de beignet entiers en utilisant une ponctuaelle avec un diamètre de 5,0 mm de pointe.
8. Retirer les particules de dispositifs de beignet avec du ruban adhésif.
9. Rincer une plaque de 12 puits avec de l'eau déminéralisée et sécher avec de l'azote. Placer la plaque dans le four à 60 ° C pendant 5 min.
10. plasma d'oxygène traiter la plaque de 12 puits à deux reprises; une fois seul pour 35 secondes, puis de nouveau avec les dispositifs de beignet pour un autre 35 secondes.
11. Placez délicatement dispositifs dans les puits de la plaque à l'aide de pinces.
12. Cuire au four avec plaque périphériques liés sur une plaque chauffante réglée à 80 ° C pendant 10 min.

2. Dosage microfluidique Préparation

1. Premiers dispositifs microfluidiques immédiatement après le traitement par plasma d'oxygène, lorsque le dispositif est hydrophile et les effets capillaires peut favoriser l'amorçage des petits canaux dans le dispositif.
2. Créer solution chimioattractive en mélangeant 5 pi fMLP [solution stock 10 uM] avec 5 pi fibronectine [solution mère à 1 mg / ml] et 490 ul de HBSS.
3. Lentement pipette & #160; solution chemoattractant dans WBLC, en utilisant une pointe de chargement de gel (figure 1A). Une pipette 20 ul supplémentaires de l'agent chimio-attractif autour de l'extérieur du dispositif.
4. Placer la plaque dans un dessiccateur pendant 15 min. Par application d'un vide à l'appareil, la solution est instillée dans les chaînes latérales de l'appareil et l'air déplacé diffuse à travers les PDMS.
5. Retirer la plaque du dessiccateur et confirmer mouillage du canal de l'appareil sous le microscope. Regardez comme bulle devient plus petit que solution chimioattractive pénètre dans la chambre. Aucune bulle ne doit être présent dans le dispositif après traitement sous vide.
6. Laver le WBLC et à l'extérieur de l'appareil à fond pour éliminer la solution de chemoattractant excès. Cette étape génère un gradient de chemoattractant de chacune des chambres chimiotactiques focaux (FCC) au centre de l'appareil.
   1. Remplir une seringue de 1 ml avec du PBS, ajouter une pointe d'aiguille émoussée 30 G à la seringue. Doucement, insérer la pointe de l'aiguille de la seringue dansau centre du trou de beignet. Poussez doucement 100 pi de PBS dans le trou de sorte qu'une goutte de formes PBS sur le dessus de l'appareil.
   2. la plaque d'inclinaison et la pipette 1 ml de PBS autour de dispositif de sorte que le liquide se rassemble au fond du puits. Aspirer le liquide de processus et de répétition pour un total de 3x en utilisant une solution tampon frais (utilisation des médias au lieu de tampon si les neutrophiles séparés seront chargés dans les médias) ^9.
7. Remplir chaque puits avec les médias jusqu'à ce que le dessus de l'appareil sont submergées par liquide. Laissez les dispositifs assis pendant 15 minutes pour permettre gradient de se stabiliser. Les résultats expérimentaux et théoriques données de simulations par éléments finis montrent que les gradients de ces dispositifs sont stables jusqu'à 24 heures pour les petites molécules (par exemple, fMLP) et jusqu'à plusieurs jours pour un plus grand poids moléculaire (par exemple, IL8).
8. En utilisant des pointes gel de chargement, la pipette lentement 2 pl de sang (ou neutrophiles isolés) dans chaque ensemble de loa sangding chambre (WBLC) (figure 1A).

3. Préparation de l'échantillon

Les neutrophiles humains De sang capillaire

1. Prélever le sang capillaire de piqûre au doigt de volontaires sains, qui est sur aucun des immunosuppresseurs. Tous les échantillons de patients ont été obtenus avec le consentement éclairé, et selon les procédures approuvées par le MGH et Shriners Institutional Review Boards.
   1. Pour la collecte de sang au bout du doigt, se laver les mains avec de l'eau et du savon et séchez la peau. Préparer une solution stock anti-coagulant/stain en ajoutant 1 ml de HBSS + 0,2% HSA et 10 pi de Hoechst tache (32,4 M) à l'héparine tube de collecte de sang (1,65 USP/50 ul de sang). Piquer le doigt avec une lancette de sécurité SurgiLance (profondeur de 2,2 mm, 22 G), essuyer la première goutte de sang et de recueillir 50 pi de sang dans tube Eppendorf contenant le stock d'anti-coagulant et solution fluorescente tache Hoechst (10 pi) et doucement mélanger.
2. Incuber le sang et Hoechst tache pendant 10 min pour permettre la coloration fluorescente noyau. Exécutez échantillon dans 1 heure de la collecte de sang.

Les neutrophiles humaines à partir de sang veineux

3. Tracer 10 ml de sang périphérique, veineuse dans des tubes contenant de l'héparine USP 33.
4. Ajouter 50 ul de sang veineux aux médias et Hoechst tache comme décrit précédemment. Incuber le sang et Hoechst tache pendant 10 min pour permettre la coloration fluorescente noyau. Exécutez échantillon dans 1 heure de la collecte de sang.

Neutrophiles Séparation De sang total - Contrôle positif

5. Pour séparer les neutrophiles, en utilisant des techniques stériles pour isoler des neutrophiles à partir de la 10 ml veineux échantillon de sang entier en utilisant Hetastarch (6% p / v) à gradient de densité, suivie par une sélection kit d'isolation de bille magnétique négatif suivant le protocole du fabricant.
6. Remis en suspension la fraction aliquote finale de neutrophiles à une concentration de 4.000 cellules / ul dans du HBSS 1X + 0,2% d'albumine de sérum humain. Maintenir les cellules à 37 ° C jusqu'au moment de lancer l'expérience.

4. Microscopie et analyse d'images pour les mesures chimiotaxie des neutrophiles

1. Régler la température de biochambre à 37 ° C, humidité de 80%, et de CO ₂ à 5%.
2. Lancer immédiatement d'utiliser l'imagerie imagerie time-lapse sur un microscope (grossissement 10X ou ultérieure).

5. Analyse statistique

1. Suivi manuel au moins 50 neutrophiles dans chaque échantillon.
2. Compter les cellules qui entrent dans le FCC au cours du temps (figure 2).
3. Calculer les vitesses de neutrophiles dans le canal entre WBLC et FCC en utilisant ImageJ (NIH) (Figure 2).
4. Quantifier la directionnalité des neutrophiles en comptant le nombre de cellules qui passent à la bifurcation et en calculant le rapport entre le nombre de cellules qui se transforment vers le FCC et les cellules qui sortent èmee dispositif. Les cellules qui ne sont pas directionnel ne suivent pas le gradient chimiotactique et, par conséquent, en nombre égal migrent vers le FCC et le canal de sortie (Figure 2).

Résultats

Le sang total (WB) essai de chimiotaxie des neutrophiles a été validé par la mesure de l'accumulation des neutrophiles vers un gradient fMLP (Film S1). Les résultats confirment que les globules rouges sont piégés par le peigne de filtration alors que les neutrophiles (bleus) sont capables de migrer activement sur ​​sang total (Figure 3A et Movie S1). Le gradient linéaire stable chimiotactique (vert), formé par l'ensemble du dispositif de microfluidiq...

Discussion

Dans ce travail, nous avons développé une plate-forme microfluidique pour mesurer la chimiotaxie des neutrophiles à partir d'une goutte de sang (2 pi). La filtration sur puce mécanique des globules rouges à partir de la migration des neutrophiles activement contourne le besoin de méthodes lourdes de séparation de cellules telles que les gradients de densité ^{10, 11} sélection positive, la sélection négative ou ^12, qui sont susceptibles d'introduire des artefacts en activant les neu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Fabrication
SU-8	Microchem	Y131273
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184 1.1 lb. Kit
Standard glass slides	Fisher Scientific	125495	1 X 3 inches
Glass-bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm	Ted Pella, Inc.	15081
Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm	Ted Pella, Inc.	15072
Microfluidic Assay Preparation and Analysis
Gel-loading pipet tip	Fisher Scientific	02-707-139
Syringe	Fisher Scientfic	309602
Blunt tip needle, 30 G ½ in.	Brico Medical Supply	BN3005
Vacutainer, Heparin	Becton Dickinson
HBSS	Sigma-Aldrich
Human serum albumin	Sigma-Aldrich	A5843-5G	0.2% final concentration in HBSS
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895-1MG
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G		SLN240
Hoescht stain	Life Technologies	H3570
Positive Control
HetaSep	STEMCELL Technologies Inc.	7906
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies Inc.	19257
Plasma Asher	March Instruments	P-250
Lindberg/Blue M Oven	Thermo Scientific	13-258-30C
Stainless Steel Precision Tweezers	Techni Tool	758TW458
Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator	Fisher Scientific	08-594-15A
Dataplate Digital Hot Plate	Alpha Multiservices	PMC 720
Nikon TiE inverted microscope	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MEA53100
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MRH20101
Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters	Chroma - Micro Video Instruments Inc.	31013v2
Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels	Qimaging - Micro Video Instruments Inc.	RET-2000R-F-M-12-C