脑Microslices的兴奋性刺激作为<em&gt;在体外</em&gt;中风模型

摘要

我们已开发了可用于检查涉及兴奋性毒性介导的脑损伤的分子机制的脑切片的模型。这种技术产生可行的成熟的脑组织，并减少所需的实验动物数量，同时保持神经回路，细胞相互作用，和突触后车厢部分完好无损。

摘要

检查涉及神经病理症状的分子机制，如缺血性中风，可以使用整个动物系统时是困难的。因此，伯或“神经元样”细胞培养系统通常利用。虽然这些系统相对容易的工作，并且是有用的模型系统中各种功能的结果（如细胞死亡）可以很容易量化的研究成果和途径培养未成熟的神经元（如兴奋毒性介导的细胞死亡途径）不一定是相同的成熟大脑观察到，或者在完整的组织。因此，有必要开发模型，其中在成熟的神经组织的细胞机制可以被检查。我们已经开发出一种体外技术，可以用于研究各种在完好的神经组织分子途径。本文描述的技术利用大鼠皮质组织，但该技术可以适用于使用组织从多种物种（如小鼠，兔，豚鼠，鸡）或脑区域（例如，海马，纹状体， 等等 ）。此外，各种刺激/治疗方法可以被使用（例如，兴奋毒性，抑制剂的施用等 ）。总之，本文所述的脑切片模型可用于研究多种参与兴奋性毒性介导的脑损伤的分子机制。

引言

中风的最常见的形式是缺血性中风，当脑血管变得闭塞而发生。该组织缺血导致从停止血流引起膜的去极化普遍，兴奋性神经递质的释放，细胞内钙，从而导致细胞死亡的活性的持续升高的途径^1。这个过程已经被称为“兴奋性中毒”，并且是参与神经元死亡的一个常见的途径由多种病症，包括中风²制备。参与兴奋性毒性及其他神经细胞死亡的级联信号通路的抑制是一个有吸引力的方式来限制中风后神经元损伤。

确定在兴奋性毒性和缺血性中风的确切分子机制可以用整体动物系统时会很困难。因此，初级胚胎和“神经元样”（ 例如 neuroblasto毫安和腺癌永生化线）细胞培养系统经常被使用。这些模型的主要优点是它们易于操作的，相对低成本，和细胞死亡可容易地测量和定量。然而，信号通路可以通过使用^3,4的培养条件，以及未成熟的神经元改变和永生线可以表达不同的受体和较成熟的大脑^5-8信号分子。此外，培养的神经元只允许一个小区类型的检测（或2，如果一个共存系统使用的），而完整的脑组织是异质的，含有多种与彼此交互的细胞类型。器官切片培养系统（薄植脑组织）也被使用，并且这些模型使细胞的异质群体的研究，因为他们被发现在体内 。但是，可以从每个动物使用这种技术时获得的组织只有数量有限，切片可未进行培养，只要永生化细胞系，并且介质给长期培养可导致改变的信号转导途径和受体的切片。尽管成熟的大脑可以被用来生成器官切片，从不成熟的脑切片更适于培养，而且更普遍使用。因此，有必要开发一种模仿或代表完整成熟的大脑，是易于使用，其中神经信号传导通路可以检查模型。

本文中， 在体外 ，涉及可用于阐明参与细胞死亡的分子机制下列的兴奋毒性或缺血性损伤完好的神经组织的技术进行说明。这种技术减少了要执行的实验所需的动物数量，是可重现的，并产生其行为在代谢上类似的方式来放大器官切片活组织。此外，神经回路，细胞相互作用，和突触后共同mpartment部分仍然完好。用生理缓冲使细胞膜“重新封装”，并且使细胞恢复其原来的膜电阻^9。这种脑片模型能够忠实地模仿观察到下列介导的兴奋性毒性脑损伤¹⁰的反应，并且可以用来检查涉及中风的分子机制。

研究方案

所有的程序都来自纽卡斯尔大学动物护理和伦理委员会，并按照相关指引及法规，包括新南威尔士州动物研究法，新南威尔士州动物研究法规和实务的澳大利亚守则进行审批保养和科学用途的动物。

1。脑组织解剖

1. 断头牺牲12周岁雄性大鼠。老鼠可以是由惊人的和断头处死，或者可以先异氟醚麻醉（5％感应，1.5-2％维护）在70％的N ₂和30％O _2，然后斩首。
2. 从头骨尽可能迅速取出大脑（理想情况下，这应该是在不到2分钟执行）。
3. 通过徒手剥离取出皮层。解剖应在尽可能短的时间来执行，用尽可能少的伤害到大脑尽可能以迈ntain切片的完整性。
4. 为了除去任何残余的皮肤，皮毛，血液等 ，浸入大脑中的37℃的Krebs缓冲液（118 mM的氯化钠，4.7 mM的氯化钾，1.3 mM的氯化钙少量（3-5毫升）中， 1.2mM的磷酸二氢钾，1.2mM的硫酸镁，25mM的碳酸氢钠，11.7毫摩尔葡萄糖，0.03 mM的乙二胺四乙酸二钠（EDTA），用95％氧/ 5％二氧化碳（卡波金），pH 7.4）中。

2。 Microslices的制备

1. 将大脑的McIlwain斩波器上的滤纸两片已放置和蘸有温暖的克雷布斯缓冲阶段。保持大脑和蘸有温暖的Krebs缓冲液的滤纸上，但没有那么湿，有可能会导致大脑左右滑动的纸张的表面上的游离液体。
2. 切片脑入250微米的冠状切片。作为营养物质，氧气和废料次在通常的血液供给交换用的流体围绕所述组织中分离的神经组织交换，切片的尺寸应不超过400微米的厚度，以便有足够的氧合和物质交换发生。
3. 转动McIlwain阶段90°。
4. 大脑切片成250微米的矢状切片。本文中，这些脑切片（250微米×250微米的切片长度可变的取决于组织的厚度）被称为microslices。
5. 将microslices进入圆底管​​10-15毫升37℃的Krebs缓冲液（所用Krebs缓冲液的量将取决于组织的量）。

3。 Microslices的平衡

1. 轻轻搅拌直至个人microslices暂停，然后让它们在重力作用下沉降。
2. 小心取出上清液，这将是阴天，由于悬浮细胞碎片，并加入10 ml新鲜的37℃Krebs缓冲液的试管中。
3. 重复此洗涤步骤4次，这将导致在去除大部分碎片的。
4. 在此之后，平衡的microslices在37℃轻轻摇动/反转，并更改Krebs缓冲液，每15分钟1小时总共。
5. 这时，加入2ml新鲜的37℃Krebs缓冲液，并转移15-20 microslices（150微升microslice暂停），以平底聚苯乙烯使用一个额外的大口径枪头平滑边缘（这可以通过创建5毫升管切〜2 mm从P1000的尖底）。均匀分布的microslices在管中的单个层的基极，以使每个microslice不进一步比从含氧气氛几毫米。

4。兴奋刺激

1. 孵育microslices在37℃，并不断通过CARBOGEN在150微升microslice悬浮液的表面上，用气相线即位置编只是microslice悬挂（避免机械破碎）的表面之上。
2. 治疗microslices与任何150微升5毫米谷氨酸+100μM甘氨酸在Krebs缓冲液（兴奋性刺激：终浓度为2.5 mM的谷氨酸+50μM甘氨酸）或150微升克雷布斯单独缓冲液（控制非刺激）。各种刺激可以用在该步骤中（包括，但不限于，AMPA，NMDA +甘氨酸，氯化钾去极化，和氧/葡萄糖剥夺）。
3. 取出培养溶液在不同时间刺激后（0，30，60，90，120，和300秒），并将其与300微升冰冷的匀浆缓冲液（30毫摩尔Tris，pH值7.4，1mM的乙二醇代替四乙酸，4毫摩尔EDTA，100μM钼酸铵，5毫焦磷酸钠，25mM的氟化钠，1mM的原钒酸钠，1mM的phenylmethanesulfonylfluoride，完全蛋白酶抑制剂混合物）。
4. 均质microslices在冰上，用的是玻璃 - 聚四氟乙烯Dounce匀浆（20杆; 700转）。
5. 店铺匀浆在-80℃下，各种信号转导分子，死亡分子等可以通过蛋白印迹分析来测定。

结果

使用此过程产生Microslices是可行的，并有多种物种（例如大鼠，小鼠和鸡），可用于产生microslices。已被利用的可行性的三个独立的措施：呼吸速率（ 图1），腺嘌呤核苷酸的比例（ 图2），和组织的钾含量（ 图3）。采用这些措施，它已经证明，microslices保持活力至少2小时后生成。

脑microslices可以用来检查各种信号转导分子，下列各种刺?...

讨论

本文中， 体外技术microslices可用于检查涉及兴奋性中毒和缺血介导的细胞死亡在完整成熟的脑组织的分子机制的生成进行说明。该技术生产的活组织（ 图1-3），即代谢类似于较大的器官切片^15。此外，这种microslice模式紧密对应观察下面的体内 ¹⁰介导的兴奋性毒性脑损伤的反应。 90秒脑 microslices与AMPA，NMDA或谷氨酸体外刺激诱 ​​导多种分子...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Guillotine			Used to decapitate animal
Surgical equipment			Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection
McIlwain chopper	McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella.		Used to generate 100-400 µm brain sections.
Round bottom plastic tubes	Greiner
Water bath			For keeping tissue at 37 °C
Humidifier/aerating apparatus			Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment
Flat bottomed polystyrene tubes	Nunc
Dounce Homogenizer