Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Zusammenfassung

Wir haben eine Hirnschnittmodell, das verwendet werden kann, um die molekularen Mechanismen der Exzitotoxizität-vermittelten-Hirn-Verletzungen beteiligt untersuchen entwickelt. Diese Technik erzeugt lebensfähigen reifen Hirngewebe und reduziert die für Experimente erforderlichen Tiernummern, unter Beibehaltung der neuronalen, zellulären Interaktionen und postsynaptischen Fächer teilweise intakt.

Zusammenfassung

Untersuchen molekularen Mechanismen neuropathologischen Bedingungen beteiligt sind, wie Schlaganfall, kann schwierig sein, wenn Sie ganze Tier-Systeme. Als solche primären oder "neuronale-like"-Zellkultursysteme werden üblicherweise verwendet. Während diese Systeme sind relativ einfach zu verarbeiten und sind nützlich Modellsysteme, bei denen verschiedene funktionelle Ergebnisse (wie Zelltod) können leicht quantifiziert werden, wobei die Ergebnisse untersucht und Wege in kultivierten unreifen Neuronen (wie Exzitotoxizität-vermittelten Zelltod Wege) sind nicht notwendigerweise die gleichen wie die in reifen Gehirns beobachtet, oder in intakte Gewebe. Daher besteht die Notwendigkeit, die Modelle, bei denen zelluläre Mechanismen in reifen Nervengewebe untersucht werden entwickeln. Wir haben ein in vitro-Verfahren, das verwendet werden kann, um eine Vielzahl von molekularen Wege in intakte Nervengewebe zu untersuchen entwickelt. Die hier beschriebene Technik nutzt Ratte Rindengewebe, aber diese Technik angepasst werden, um Gewebe zu verwendenaus einer Vielzahl von Arten (wie z. B. Maus, Kaninchen, Meerschweinchen und Huhn) oder Hirnregionen (zB Hippocampus, Striatum, etc.). Zusätzlich kann eine Vielzahl von Reizen / Behandlungen verwendet werden (zum Beispiel excitotoxisch Verabreichung von Inhibitoren, etc.). Abschließend kann die hier beschriebene Hirnschnittmodell verwendet, um eine Vielzahl von molekularen Mechanismen vermittelten Exzitotoxizität beteiligt Gehirnverletzung zu untersuchen.

Einleitung

Die häufigste Form des Schlaganfalls ist ischämischen Schlaganfall, die, wenn eine zerebrale Blutgefäß wird verschlossenen auftritt. Die Gewebe, die aus Ischämie Aufhören des Blutflusses führt verursacht verbreitet Depolarisation von Membranen, die Freisetzung von exzitatorischen Neurotransmittern und anhaltende Erhöhung von intrazellulärem Calcium, was zu der Aktivierung von Zelltod führt Pfade ^1. Dieser Prozess wurde "Exzitotoxizität" bezeichnet, und ist ein gemeinsamer Weg in neuronalen Tod beteiligt durch eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Schlaganfall ² hergestellt. Die Hemmung der Signalwege in Exzitotoxizität und anderen neuronalen Zelltod Kaskaden ist ein attraktiver Ansatz zur neuronalen Schäden nach Schlaganfall zu begrenzen.

Die Ermittlung der genauen molekularen Mechanismen der Exzitotoxizität und ischämischen Schlaganfall beteiligt, kann schwierig sein, wenn Sie ganze Tier-Systeme. Als solche primären embryonalen und "neuronale-like '(zB neuroblastoma und Adenokarzinom immortalisierten Linien) Zellkultursysteme werden oft verwendet. Die Hauptvorteile dieser Modelle sind, dass sie leicht zu handhaben, relativ kostengünstig, und Zelltod kann leicht gemessen und quantifiziert werden. Allerdings kann Signalwege von den Kulturbedingungen verwendet, ^3,4, und unreife Nervenzellen verändert und verewigt Linien können verschiedene Rezeptoren exprimieren und Signalmoleküle im Vergleich zu Hirn ^5-8 reifen. Weiterhin kultivierten Neuronen erlauben nur die Prüfung von einem Zelltyp (oder zwei, wenn eine Co-Kultur-System verwendet wird), wohingegen intakte Hirngewebe ist heterogen, mit einer Vielzahl von Zelltypen, die miteinander interagieren. Organotypischen Kultursysteme (dünne Explantate des Hirngewebes) eingesetzt, und diese Modelle ermöglichen die Untersuchung von heterogenen Populationen von Zellen, wie sie in vivo gefunden. Jedoch kann nur eine begrenzte Menge an Gewebe von jedem Tier bei der Verwendung dieser Technik erhalten werden, können Scheibennicht so lange wie immortalisierte Zelllinien gezüchtet werden, und mittel-bis langfristige Kultur kann in Veränderungen der Signalwege und Rezeptoren in den Scheiben führt. Während reifen Gehirn kann verwendet werden, um organotypischen Slices erzeugen, sind Scheiben aus unreifen Gehirn empfänglicher für Kultur und sind häufiger eingesetzt. Es besteht daher die Notwendigkeit, die Modelle, die nachahmen oder darstellen intakten reifen Gehirn, die einfach zu bedienen sind, in der neuronalen Signalwege untersucht werden können zu entwickeln.

Hierin wird ein in vitro-Technik, die intakte Nervengewebe, die verwendet werden, um die molekularen Mechanismen der Zelltod aufzuklären nach einer exzitatorischen oder ischämischen Insult beschrieben. Diese Technik reduziert die Anzahl der benötigten Tiere, ein Experiment durchzuführen, ist reproduzierbar und erzeugt lebensfähigem Gewebe, die in einer ähnlichen Weise metabolisch größer organotypischen Scheiben verhält. Zusätzlich wird die neuronalen, zellulären Interaktionen und postsynaptischen Zusammenarbeitmpartment bleibt teilweise intakt. Die physiologische Puffer verwendet wird, erlaubt die Zellmembranen zu "reseal 'und ermöglicht Zellen zu ihrer ursprünglichen Membranwiderstand ⁹ erholen. Diese Hirnschnitt-Modell ist in der Lage, getreu nachahmen folgenden vermittelten Exzitotoxizität Hirnverletzungen ¹⁰ beobachteten Reaktionen und kann verwendet werden, um die molekularen Mechanismen in der Schlaganfall beteiligt zu untersuchen.

Protokoll

Alle Vorgänge werden mit Genehmigung durch die Universität von Newcastle Animal Care und Ethik-Kommission sowie in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften, einschließlich der NSW Tierforschungsgesetz, das NSW Tierforschung Verordnung und der australischen Verhaltenskodex für die durchgeführt Pflege und Verwendung von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken.

1. Dissection von Hirngewebe

1. Sacrifice 12 Wochen alte männliche Ratten durch Enthauptung. Ratten können entweder durch atemberaubende und Enthauptung getötet werden, oder es kann zunächst mit Isofluran (5% Induktion, 1,5-2% Wartung) in 70% N ₂ und 30% O ₂ anästhesiert werden, und dann enthauptet.
2. Entfernen das Gehirn aus dem Schädel so schnell wie möglich (im Idealfall sollte dies in weniger als 2 Minuten durchgeführt werden.)
3. Entfernen Sie die Rinde von Freihand-Dissektion. Die Präparation ist in kürzester Zeit möglich durchgeführt werden, mit so wenig Schädigung des Gehirns wie möglich, um maintain die Unversehrtheit der Scheiben.
4. Um jegliche Rest Haut zu entfernen, Fell, Blut, usw., tauchen das Gehirn in einer kleinen Menge (3-5 ml) von 37 ° C Krebs-Puffer (118 mM Natriumchlorid, 4,7 mM Kaliumchlorid, 1,3 mM Calciumchlorid, 1,2 mM Kaliumdihydrogenphosphat, 1,2 mM Magnesiumsulfat, 25 mM Natriumhydrogencarbonat, 11,7 mM Glucose, 0,03 mM Dinatrium-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), mit 95% Sauerstoff / 5% Kohlendioxid (Carbogen), pH 7,4) äquilibriert.

2. Vorbereitung der Microslices

1. Legen Sie das Gehirn auf der Bühne eines McIlwain Chopper auf der zwei Scheiben aus Filterpapier platziert wurden und in warmen Krebs-Puffer befeuchtet. Halten das Gehirn und das Filterpapier mit warmem Krebs-Puffer benetzt, aber nicht so feucht, dass freie Flüssigkeit auf der Oberfläche des Papiers, die dazu führen kann, um das Gehirn herum gleiten.
2. Schneiden Sie das Gehirn in 250 um koronalen Abschnitte. Als Nährstoffe, Sauerstoff und Abfallstoffe thbei normalerweise mit der Blutversorgung mit einem Fluid, die das Gewebe in isolierten Nervengewebe umgibt ausgetauscht ausgetauscht, die Größe der Scheiben nicht mehr als 400 um dick sein, damit eine angemessene Sauerstoffversorgung und Stoffaustausch stattfindet.
3. Drehen Sie den McIlwain Stufe 90 °.
4. Gehirn in Scheiben schneiden 250 um sagittal. Hier sind diese Gehirnschnitte (250 &mgr; m × 250 &mgr; m Schnitte mit variabler Länge abhängig von der Dicke des Gewebes) werden als microslices bezeichnet.
5. Platzieren Sie die microslices in einen Rundrohr mit 10-15 ml 37 ° C Krebs-Puffer (die Menge von Krebs-Puffer wird auf die Menge des Gewebes abhängen).

3. Equilibrierung Microslices

1. Vorsichtig geschwenkt, bis einzelne microslices aufgehängt sind, und es ihnen ermöglichen, unter der Schwerkraft zu begleichen.
2. Vorsichtig den Überstand zu entfernen, die trübe durch Zelltrümmer ausgesetzt sein wird, und 10 ml 37 ° C FrischKrebs-Puffer mit dem Rohr.
3. Wiederholung dieser Waschprozedur viermal, was bei der Entfernung der meisten Schmutz führt.
4. Danach ins Gleichgewicht microslices die bei 37 ° C unter leichtem Schütteln / Inversion, und ändern Sie das Krebs-Puffer alle 15 min für 1 Stunde in total.
5. Zu dieser Zeit, 2 ml 37 ° C Frisch Krebs-Puffer, und übertragen 15-20 microslices (150 ul Microslice Suspension) zu flachen Boden 5 ml Polystyrolröhrchen mit einem extra breiten Bohrung Pipettenspitze mit geglätteten Kanten (die erstellt werden können Schneid ~ 2 mm von dem Ende einer P1000 Tipp). Spread die microslices gleichmäßig über den Boden des Rohres in einer einzelnen Schicht, so dass jedes Microslice nicht weiter als einige wenige Millimeter von der mit Sauerstoff angereicherten Atmosphäre.

4. Exzitotoxische Stimulation

1. Die microslices Bei 37 ° C und ständig passieren über die Oberfläche des 150 ul Microslice Suspension CARBOGEN, mit einer Gasleitung, die Positioned gerade über die Oberfläche des Microslice-Suspension (in mechanische Störung zu vermeiden).
2. Gönnen microslices entweder mit 150 ul 5 mM Glutamat + 100 uM Glycin in Krebs-Puffer (exzitotoxische Reiz: Endkonzentration 2,5 mM Glutamat + 50 uM Glycin) oder 150 ul Krebs allein Puffer (Kontrolle nicht stimulierten). Eine Vielzahl von Stimuli können in diesem Schritt verwendet werden (einschließlich, aber nicht beschränkt auf, AMPA-, NMDA + Glycin, KCl-Depolarisation und Sauerstoff / Glucose-Entzug).
3. Entfernen Sie die Inkubationslösung zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation (0, 30, 60, 90, 120 und 300 Sekunden), und ersetzen Sie es mit 300 ul eiskaltem Homogenisierung Puffer (30 mM Tris, pH 7,4, 1 mM Ethylenglycol tetraessigsäure, 4 mM EDTA, 100 &mgr; M Ammoniummolybdat, 5 mM Natriumpyrophosphat, 25 mM Natriumfluorid, 1 mM Natriumorthovanadat, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride vollständige Proteaseinhibitor-Cocktail).
4. Homogenisieren microslices auf Eis, mit einem Glas-Teflon-Homogenisator Dounce(20 Schläge, 700 rpm).
5. Speicher Homogenate bei -80 ° C, und verschiedene Signalmoleküle, Tod Moleküle usw. können durch Western-Blot gemessen werden.

Ergebnisse

Microslices erzeugt unter Verwendung dieses Verfahrens lebensfähig sind, und eine Vielzahl von Arten (z. B. Ratte, Maus und Huhn) auf microslices verwendet werden. Drei voneinander unabhängige Maßnahmen der Rentabilität verwendet worden: Atemfrequenz (Abbildung 1), Adenin-Nukleotid-Verhältnisse (Abbildung 2), und Gewebekaliumgehalt (Abbildung 3). Durch diese Maßnahmen hat es sich gezeigt, dass microslices lebensfähig bleiben für mindestens 2 h nach der Erzeugung...

Diskussion

Hierin wird ein in vitro-Verfahren zur Erzeugung von microslices, die verwendet werden können, um die molekularen Mechanismen der Exzitotoxizität und Ischämie-vermittelten Zelltod in intakten reifen Hirngewebe beteiligt untersuchen beschrieben. Diese Technik produziert lebensfähiges Gewebe (Abb. 1-3), das ist metabolisch ähnlich größer organotypischen ¹⁵ Scheiben. Außerdem diese Microslice-Modell eng entspricht der folgenden vermittelten Exzitotoxizität Hirnverletzungen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Guillotine			Used to decapitate animal
Surgical equipment			Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection
McIlwain chopper	McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella.		Used to generate 100-400 µm brain sections.
Round bottom plastic tubes	Greiner
Water bath			For keeping tissue at 37 °C
Humidifier/aerating apparatus			Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment
Flat bottomed polystyrene tubes	Nunc
Dounce Homogenizer