Excitotóxica Estimulación del cerebro Microslices como<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Carrera

Resumen

Hemos desarrollado un modelo de cortes de cerebro que se puede utilizar para examinar los mecanismos moleculares implicados en la lesión cerebral excitotoxicidad mediada. Esta técnica genera tejido cerebral madura viable y reduce el número de animales necesarios para la experimentación, mientras que mantiene los circuitos neuronales, las interacciones celulares y compartimentos postsinápticos parcialmente intacta.

Resumen

El examen de los mecanismos moleculares implicados en condiciones neuropatológicos, tales como accidente cerebrovascular isquémico, puede ser difícil cuando se utilizan sistemas de animales enteros. Como sistemas de cultivo neuronal '-como' células tales, primaria o se utilizan comúnmente. Si bien estos sistemas son relativamente fáciles de trabajar con, y son sistemas modelo útil en el que diversos resultados funcionales (tales como la muerte celular) pueden cuantificarse fácilmente, los resultados examinados y vías en neuronas inmaduras cultivadas (tales como vías de la muerte celular mediada por excitotoxicidad-) no son necesariamente los mismos que los observados en el cerebro maduro, o en el tejido intacto. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar modelos en los que los mecanismos celulares en el tejido neural madura puede ser examinado. Hemos desarrollado una técnica in vitro que se puede utilizar para investigar una variedad de vías moleculares en el tejido nervioso intacto. La técnica descrita en este documento utiliza tejido cortical de rata, pero esta técnica se puede adaptar para utilizar el tejidoa partir de una variedad de especies (tales como ratón, conejo, conejillo de indias, y pollo) o regiones del cerebro (por ejemplo, hipocampo, cuerpo estriado, etc.) Además, una variedad de estímulos / tratamientos se puede utilizar (por ejemplo, excitotoxicidad, la administración de inhibidores, etc). En conclusión, el modelo de cortes de cerebro se describe en el presente documento puede usarse para examinar una variedad de mecanismos moleculares implicados en la lesión cerebral excitotoxicidad mediada.

Introducción

La forma más común de accidente cerebrovascular es el accidente cerebrovascular isquémico, que se produce cuando un vaso sanguíneo cerebral se ocluye. La isquemia tisular que resulta de la cesación del flujo de sangre causa la despolarización de las membranas generalizada, liberación de neurotransmisores excitadores, y la elevación sostenida de calcio intracelular, lo que conduce a la activación de la muerte celular pathways ^1. Este proceso ha sido denominado 'excitotoxicidad', y es una vía común implicado en la muerte neuronal producida por una variedad de patologías, incluyendo accidente cerebrovascular ^2. La inhibición de las vías de señalización implicadas en la excitotoxicidad y otras cascadas de muerte celular neuronal es un enfoque atractivo para limitar el daño neuronal después de un accidente cerebrovascular.

La identificación de los mecanismos moleculares exactos involucrados en la excitotoxicidad y el ictus isquémico puede ser difícil cuando se utilizan sistemas de animales enteros. Como tal, embrionaria primaria y 'tipo neuronal "(por ejemplo neuroblastoma y de adenocarcinoma de líneas inmortalizadas) se utilizan a menudo sistemas de cultivo celular. Las principales ventajas de estos modelos es que son fáciles de manipular, relativamente rentable, y la muerte celular se pueden medir fácilmente y se cuantificaron. Sin embargo, las vías de señalización pueden ser alterados por las condiciones de cultivo utilizadas ^3,4, y las neuronas inmaduras y líneas inmortalizadas pueden expresar diferentes receptores y moléculas de señalización en comparación con madurar cerebro ^5-8. Además, las neuronas cultivadas sólo permiten el examen de un tipo de célula (o dos, si se utiliza un sistema de cocultivo), mientras que el tejido cerebral intacta es heterogéneo, que contiene una variedad de tipos de células que interactúan entre sí. También se utilizan sistemas de cultivo de cortes organotípicos (explantes delgadas de tejido cerebral), y estos modelos permiten el estudio de poblaciones heterogéneas de células como se encuentran in vivo. Sin embargo, sólo una cantidad limitada de tejido se puede obtener de cada animal cuando se utiliza esta técnica, las rebanadas puedeNo se cultivaron durante tanto tiempo como líneas celulares inmortalizadas, y medio para el cultivo a largo plazo puede dar lugar a alteraciones en las vías de señalización y los receptores en las rebanadas. Mientras que el cerebro madura puede ser utilizado para generar rebanadas organotípicos, rodajas de cerebro inmaduro son más susceptibles a la cultura, y son más comúnmente utilizados. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar modelos que imitan o representan cerebro maduro intacto, que son fáciles de usar, en la que las vías de señalización neuronales pueden ser examinados.

En la presente memoria, se describe una técnica in vitro que implica tejido nervioso intacto que se puede utilizar para elucidar los mecanismos moleculares implicados en la muerte celular después de un insulto excitotóxica o isquémica. Esta técnica reduce el número de animales necesarios para llevar a cabo un experimento, es reproducible, y genera tejido viable que se comporta de una manera similar a metabólicamente rebanadas organotípicos más grandes. Además, la circuitería neuronal, las interacciones celulares, y co postsinápticampartment permanece parcialmente intacta. El tampón fisiológico utilizado permite que las membranas celulares para 'resellado ", y permite que las células recuperan su resistencia de la membrana ⁹ original. Este modelo de cortes de cerebro es capaz de imitar fielmente respuestas observadas después de la excitotoxicidad mediada por lesiones cerebrales ^10, y se puede utilizar para examinar los mecanismos moleculares implicados en el accidente cerebrovascular.

Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación de la Universidad de Newcastle Cuidado de Animales y el Comité de Ética, así como de conformidad con las directrices y normas pertinentes, entre ellas la Ley de NSW Investigación Animal, Animal Reglamento Investigación NSW, y el Código Australiano de Prácticas para la cuidado y uso de animales con fines científicos.

1. La disección del tejido cerebral

1. Sacrificio doce semanas de edad ratas macho por decapitación. Las ratas pueden o bien ser sacrificados por el aturdimiento y la decapitación, o pueden ser primero anestesiados con isoflurano (5% de la inducción, mantenimiento 1,5-2%) en el 70% de _N2 y 30% de O _2, y luego decapitados.
2. Retire el cerebro contra el cráneo lo más rápidamente posible (idealmente, esto debería llevarse a cabo en menos de 2 minutos).
3. Retirar la corteza por la disección a mano alzada. La disección se debe realizar en el menor tiempo posible, con el menor daño al cerebro como sea posible a fin de maintain la integridad de las rebanadas.
4. Con el fin de eliminar cualquier residual de la piel, piel, sangre, etc, sumerja el cerebro en una pequeña cantidad (3-5 ml) de 37 ° C tampón de Krebs (118 mM de cloruro de sodio, cloruro de potasio 4,7 mM, cloruro de calcio 1,3 mM, 1,2 mM de potasio dihidrógeno fosfato, sulfato de magnesio 1,2 mM, carbonato de hidrógeno de sodio 25 mM, glucosa 11,7 mM, 0,03 mM de disodio de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), equilibrada con 95% de oxígeno / dióxido de carbono al 5% (carbógeno), pH 7,4).

2. Preparación de Microslices

1. Coloque el cerebro en el escenario de un helicóptero McIlwain en el que se han colocado dos rebanadas de papel de filtro y humedecido con tampón de Krebs caliente. Mantener el cerebro y papel de filtro humedecido con tampón de Krebs caliente, pero no tan húmeda que hay líquido libre en la superficie del papel que puede causar que el cerebro se deslice alrededor.
2. Cortar el cerebro en 250 micras secciones coronales. Como nutrientes, oxígeno y materiales de desecho ªen el que normalmente se intercambian con el suministro de sangre se intercambian con un fluido que rodea el tejido en el tejido neural aislado, el tamaño de las rodajas no debe ser más de 400 m de espesor para permitir la oxigenación adecuada de nutrientes y de cambio que se produzca.
3. Gire la etapa McIlwain 90 °.
4. Cortar cerebros en 250 micras sagital. En la presente memoria, estas secciones de cerebro (250 micras x 250 micras rebanadas de longitud variable en función del espesor del tejido) se conocen como microslices.
5. Coloque los microslices en un tubo de fondo redondo con 10-15 ml de tampón C 37 ° de Krebs (la cantidad de tampón de Krebs utilizado dependerá de la cantidad de tejido).

3. La equilibración de Microslices

1. Agitar suavemente hasta que se suspenden microslices individuales, y luego permitir que se asienten por gravedad.
2. Retire con cuidado el sobrenadante, que será turbia debido a los desechos de células en suspensión, y añadir 10 ml fresco 37 ° CKrebs búfer al tubo.
3. Repita este procedimiento de lavado cuatro veces, lo que se traducirá en la eliminación de la mayoría de los desechos.
4. Después de esto, se equilibren las microslices a 37 ° C con agitación suave / inversión, y cambiar el tampón Krebs cada 15 minutos durante 1 hora en total.
5. En este momento, añadir 2 ml de tampón de 37 ° C Krebs fresco, y transferir 15-20 microslices (150 l de suspensión MicroSlice) al poliestireno de fondo plano de tubos de 5 ml usando una punta de pipeta de calibre extra ancho con bordes suavizados (que pueden ser creados por de corte ~ 2 mm desde el extremo de una punta de P1000). Extender las microslices de manera uniforme sobre la base del tubo en una sola capa, de manera que cada MicroSlice no está a más de unos pocos milímetros de la atmósfera oxigenada.

4. La estimulación excitotóxica

1. Incubar las microslices a 37 ° C, y pasar continuamente CARBOGEN sobre la superficie de la suspensión 150 l MicroSlice, utilizando una línea de gas que es la posicióned justo por encima de la superficie de la suspensión MicroSlice (para evitar la interrupción mecánica).
2. Tratar microslices con ya sea el glutamato 150 l 5 mm + 100 mM de glicina en tampón de Krebs (estímulo excitotóxica: concentración final 2,5 mM de glutamato + 50 mM glicina) o 150 l de tampón de Krebs solo (control nonstimulated). Una variedad de estímulos se puede utilizar en este paso (incluyendo, pero no limitado a, AMPA, NMDA + glicina, KCl despolarización, y el oxígeno / glucosa privación).
3. Eliminar la solución de incubación a varios tiempos después de la estimulación (0, 30, 60, 90, 120, y 300 seg), y reemplazarla con 300 l de helado de tampón de homogeneización (30 mM de Tris, pH 7,4, 1 mM de etileno glicol ácido tetraacético, EDTA 4 mM, 100 mM de molibdato de amonio, pirofosfato de sodio 5 mM, fluoruro de sodio 25 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, phenylmethanesulfonylfluoride 1 mM, cóctel inhibidor de proteasa completo).
4. Homogeneizar microslices en hielo, con un vaso de teflón Dounce Homogeneizador(20 golpes; 700 rpm).
5. Homogeneizados Almacenar a -80 ° C, y varias moléculas de señalización, las moléculas de muerte, etc se pueden medir por Western blot.

Resultados

Microslices generados usando este procedimiento son viables, y una variedad de especies (por ejemplo, rata, ratón y pollo) se pueden utilizar para producir microslices. Se han utilizado tres medidas independientes de viabilidad: la tasa de respiración (Figura 1), los coeficientes de nucleótidos adenina (Figura 2), y contenido de potasio tisular (Figura 3). El uso de estas medidas, se ha demostrado que microslices permanecen viables durante al menos 2 horas después d...

Discusión

En la presente memoria, se describe una técnica in vitro para la generación de microslices que se pueden utilizar para examinar los mecanismos moleculares implicados en la excitotoxicidad y muerte celular mediada por la isquemia en el tejido cerebral madura intacta. Esta técnica produce tejido viable (Figuras 1-3), que es metabólicamente similar a rebanadas organotípicos más grandes ^15. Además, este modelo MicroSlice corresponde estrechamente a la respuesta observada ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Guillotine			Used to decapitate animal
Surgical equipment			Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection
McIlwain chopper	McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella.		Used to generate 100-400 µm brain sections.
Round bottom plastic tubes	Greiner
Water bath			For keeping tissue at 37 °C
Humidifier/aerating apparatus			Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment
Flat bottomed polystyrene tubes	Nunc
Dounce Homogenizer