같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

요약

우리는 흥분 독성 매개 성 뇌 손상에 관련된 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수있는 뇌 슬라이스 모델을 개발 하였다. 이 기술은 실행 가능한 성숙한 뇌 조직을 생성하고, 부분적으로 손상 신경 회로, 세포 상호 작용과 시냅스 구획을 유지하면서, 실험에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다.

초록

전체 동물 체제를 사용하는 경우 허혈성 뇌졸중과 같은 신경 병리학 적 조건에 관련된 분자 메커니즘을, 검사, 어려울 수 있습니다. 예컨대, 기본 또는 '신경 조의'세포 배양 시스템은 일반적으로 이용된다. 이러한 시스템은 작동 비교적 용이하며, (예컨대 세포사와 같은) 다양한 기능적 결과를 쉽게 정량화 될 수있는 유용한 모델 시스템 (예 흥분 독성 - 매개 세포 사멸 경로 등) 배양 된 미숙 뉴런의 조사 결과와 경로이지​​만 반드시 성숙한 뇌에서 관찰 된 것과 같은, 또는 손상 조직에 없습니다. 따라서, 성숙한 신경 조직의 세포 메커니즘을 조사 할 수있는 모델을 개발할 필요가있다. 우리는 신경 조직 손상의 분자 경로의 다양성을 조사하기 위해 사용될 수있는 시험 관내 기술을 개발했다. 설명 된 기술은 본 명세서 쥐 대뇌 피질 조직을 활용하지만,이 기술은 조직을 사용하도록 구성 될 수있다또는 뇌 영역 (예를 들어, 해마, 선조체, 등) (예 : 마우스, 토끼, 기니 돼지, 닭 등) 종의 다양 한에서. 또한, 자극 / 치료의 다양한 (예를 들어, 흥분 독성, 억제제의 투여 등)을 사용할 수있다. 결론적으로, 본원에 기재된 뇌 슬라이스 모델 흥분 독성 매개 성 뇌 손상에 관련된 분자 메커니즘의 다양성을 조사 할 수있다.

서문

뇌졸중의 가장 일반적인 형태는 대뇌 혈관 폐색 될 때 발생하는 허혈성 뇌졸중이다. 혈액의 흐름 중단 한 결과 조직의 국소 빈혈은 세포막의 탈분극 확산, 흥분성 신경 전달 물질의 방출을 일으키고, 세포 죽음의 활성화에 이르게 세포 내 칼슘의 지속적인 상승은 ¹ 경로. 이 과정은 '흥분 독성 (excitotoxicity)'라고하고, 스트로크 ² 등의 병리의 다양한 의해 생성 된 신경 세포의 죽음에 관련된 일반적인 경로입니다되었습니다. 흥분 독성 및 다른 신경 세포 죽음의 계곡에 관련된 신호 전달 경로의 억제는 뇌졸중 다음 신경 세포의 손상을 제한 할 수있는 매력적인 방법입니다.

동물 전체 시스템을 사용할 때 흥분 독성 (excitotoxicity)과 허혈성 뇌졸중에 관련된 정확한 분자 메커니즘을 확인하는 것은 어려울 수 있습니다. 같은 차 배아와 '신경과 같은'(예를 들어 neuroblasto로엄마와 선암 불후의 선)는 세포 배양 시스템은 자주 사용된다. 이러한 모델의 주요 이점들은, 상대적으로 비용 효과적인 쉽게 조작 할 수 있으며 세포 사멸이 용이하고 정량 측정 할 수 있다는있다. 그러나, 신호 전달 경로는 배양 ^3,4를 사용 조건 및 미성숙 신경 세포에 의해 변경하고 선이 다른 수용체를 표현하고 뇌 ^{5-8 성숙에} 비해 신호 분자 수 불멸 할 수 있습니다. (공 배양 시스템이 사용되는 경우, 또는 2 개)의 손상 뇌 조직이 서로 상호 작용하는 다양한 종류의 세포를 함유하는 이종 반면 또한, 배양 된 신경 세포는 단지 하나의 세포 유형의 검사를 허용한다. Organotypic 슬라이스 배양 시스템 (뇌 조직의 얇은 절편)도 사용되며, 이들이 생체 내에서 발견되는 이러한 모델은 이종의 세포 집단의 연구를 허용한다. 이 기술을 사용하는 경우에는, 조직의 제한된 양 슬라이스는, 각각의 동물로부터 수득 할 수있다한 불후의 세포주로 배양 할, 장기 문화 매체는 슬라이스의 경로와 수용체 신호에 변화가 발생할 수 없습니다. 성숙한 두뇌의 Organotypic 조각을 생성하는 데 사용할 수있는 반면, 미성숙 뇌에서 슬라이스 문화에 더 많은 의무, 그리고 더 일반적으로 사용된다. 신경 신호 전달 경로를 검사 할 수있는 사용하기 쉬운 그대로 성숙한 뇌, 모방 또는 표현 모델을 개발하기 위해 필요하다.

여기서, 흥분 독성 또는 허혈성 모욕 다음 세포사에 관여 분자 메커니즘을 규명하는 데 사용할 수있는 손상 신경 조직을 포함하는 생체 외 기법을 설명한다. 이 기술은, 실험을 수행하는 데 필요한 동물의 수를 감소 재현이며, 더 큰 슬라이스의 Organotypic 대사 유사한 방식으로 동작 가능한 조직을 생성한다. 또한, 신경 회로, 셀룰러 상호 작용 및 시냅스 콜로라도mpartment 부분적으로 그대로 유지됩니다. 사용되는 생리 버퍼는 셀 '봉인'에 막, 그리고 수 세포가 원래의 막 저항 ^9를 복구 할 수 있습니다. 이 뇌 조각 모델을 충실하게 흥분 독성 매개 뇌 손상 ¹⁰ 다음 관찰 된 반응을 모방 할 수있다, 뇌졸중에 관련된 분자 메커니즘을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

모든 절차는 NSW 동물 연구 법, NSW 동물 연구 규정 및 대한 연습의 호주 코드를 포함하여 관련 지침 및 규정에 따라뿐만 아니라 뉴캐슬 대학의 동물 관리 및 윤리위원회에서 승인을 수행 관리 및 과학적인 목적을위한 동물의 사용.

1. 뇌 조직의 해부

1. 잘린 십이주 된 수컷 쥐를 희생. 쥐도 근사하고 잘린 희생 할 수있다, 또는 최초의 이소 플루 란 (5 % 유도, 1.5 % 유지) 70 % N ₂ 30 %의 O ₂ 마취 할 수 있고, 그 목을 베.
2. 가능한 빨리 두개골에서 뇌를 제거 (이상적으로,이보다 2 분에 수행해야합니다).
3. 프리 핸드의 해부에 의해 피질을 제거합니다. 마이하도록 절개 가능한 뇌 적게 손상, 가능한 최단 시간 내에 수행되어야슬라이스의 무결성을 ntain.
4. 잔류 피부를 제거하기 위해, 기타 퍼, 혈액,,, 37 ° C 크렙스 완충액 (118 mM 염화나트륨, 4.7 mM의 염화칼륨, 1.3 mM의 염화칼슘의 소량 (3-5 ml)에 뇌를 담가 1.2 ㎜의 인산이 수소 칼륨, 1.2 mM의 황산 마그네슘, 25 mM의 나트륨, 탄산 수​​소, 11.7 mM의 글루코오스, 0.03 mM의 디 나트륨 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 95 % 산소 / 5 % 이산화탄소 (carbogen)의 pH 7.4)로 평형화.

2. Microslices의 준비

1. 여과지의 두 조각을 배치하고 따뜻한 크렙스 버퍼를 살짝 묻혀있다하는 맥일 웨인 헬기의 무대에서 뇌를 놓습니다. 두뇌와 따뜻한 크렙스 버퍼에 적신 여과지를 유지하지만 너무 젖은 뇌가 미끄러지지 않을 수 있습니다 종이의 표면에 액체가 무료입니다.
2. 250 μm의 코로나 섹션으로 머리를 조각. 영양소, 산소 및 노폐물 th로일반적으로 혈액 공급이 절연 신경 조직에서 조직을 둘러싸는 유체 교환하여 교환에서, 슬라이스의 사이즈는 적절한 산소 및 영양소 교환이 발생할 수 있도록하는 두께로 400 μM이어야한다.
3. 맥일 웨인 단계 90 ° 돌립니다.
4. 250 μm의 시상 조각으로 머리를 조각. 여기서, 이러한 뇌 섹션 (가변 길이의 250 μM × 250 μm의 슬라이스 조직의 두께에 따라) microslices로 지칭된다.
5. (사용 크렙스 버퍼의 양이 조직의 양에 따라 달라집니다) 15 ㎖를 37 ° C 크렙스 버퍼 둥근 바닥 튜브에 microslices를 놓습니다.

3. Microslices의 평형

1. 부드럽게 개별 microslices가 일시 중단 될 때까지 교반 한 후 그 중력에서 해결 할 수 있습니다.
2. 조심스럽게 인해 일시 중단 된 세포 파편에 흐린 될 상층 액을 제거하고 신선한 37 ° C 10 mL를 넣고크렙스는 튜브에 버퍼.
3. 파편의 대부분 제거 될 것이다,이 세척 절차를 네 번 반복합니다.
4. 이 후, 부드러운 흔들림 / 반전으로 37 ° C에서 microslices을 평형 및 크렙스는 총 1 시간 동안 매 15 분을 버퍼로 변경합니다.
5. 이 때, 2 ML 신선한 37 ° C 크렙스 버퍼를 추가하고 평평한 바닥 폴리스티렌 15-20 microslices (microslice 현탁액 150 μL)를 전송하여 만들 수 있습니다 부드럽게 가장자리 (과 여분의 넓은 구멍 피펫 팁을 사용하여 5 ㎖ 튜브 P1000 팁의 끝에서 1 ~ 2 mm 절삭). 각 microslice가 산소 분위기에서 몇 밀리미터보다 더되지 않도록, 단층의 튜브의 기부에 균일 microslices 스프레드.

4. 흥분 독성 자극

1. 37 ° C에서 microslices을 품어, 지속적으로 위치하는 가스 라인을 사용하여 150 μL의 microslice 서스펜션의 표면에 carbogen 전달다만 microslice 서스펜션 (기계 혼란을 피하기 위해)의 표면 위에 에드.
2. (: 최종 농도 2.5 mM의 글루타민산 염 + 50 μM 글리신 흥분 독성 자극) 또는 단독으로 150 μL 크렙스 버퍼 (nonstimulated를 제어) 150 ㎕의 5 mM의 글루타민산 염 + 100 크렙스 버퍼 μM 글리신과 microslices을 처리합니다. 다양한 자극이 단계에서 사용될 수있다 (를 포함 하나 이에 국한되지 않는 AMPA, NMDA + 글리신, 탈분극의 KCl, 및 산소 / 글루코스 부족).
3. 여러 번 후 자극 (0, 30, 60, 90, 120, 300 초)에서 배양 용액을 제거하고 얼음처럼 차가운 균질화 버퍼 (30 MM 트리스, 산도 7.4, 1 ㎜의 에틸렌 글리콜의 300 μL로 교체 디아민 테트라 아세트산, 4 mM의 EDTA, 100 μM 몰리브덴 산 암모늄, 5 mM의 나트륨 피로 포스페이트, 25 mM의 불소화 나트륨, 1 mM의 나트륨 오르토 바나 데이트, 1 밀리미터 phenylmethanesulfonylfluoride 완전 프로테아제 억제제 칵테일).
4. 유리 테플론 다운스 균질화를 사용하여 얼음에 microslices 균질화(20 스트로크, 700 RPM).
5. 등 -80 ° C 및 다양한 신호 분자, 죽음 분자에 보관 균질 서양 얼룩에 의해 측정 할 수있다.

결과

이 절차를 사용하여 생성 Microslices가 실용적이며, 종의 다양성 (예를 들어, 래트, 마우스, 닭) microslices을 생성하기 위하여 사용될 수있다. 생존의 세 가지 독립적 인 조치를 활용 한 : 호흡 속도 (그림 1), 아데닌 뉴클레오티드 비율 (그림 2), 및 조직의 칼륨 함량 (그림 3). 이러한 방법을 사용하면, microslices 적어도 2 시간 후 생성을 위해 실행 가능한 남아 있다고 ...

토론

여기서, 본래 성숙한 뇌 조직에서 흥분 독성 및 허혈 - 매개 세포 사멸에 관여하는 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수 microslices의 생성을위한 시험 관내 기술이 설명된다. 이 기술은 실행 가능한 조직 (1-3 피규어), 즉 큰의 Organotypic 조각 ¹⁵ 대사와 유사하다을 생산하고 있습니다. 또한,이 microslice 모델은 밀접하게 생체 내 ¹⁰ 흥분 독성 매개 뇌 손상 다?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Guillotine			Used to decapitate animal
Surgical equipment			Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection
McIlwain chopper	McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella.		Used to generate 100-400 µm brain sections.
Round bottom plastic tubes	Greiner
Water bath			For keeping tissue at 37 °C
Humidifier/aerating apparatus			Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment
Flat bottomed polystyrene tubes	Nunc
Dounce Homogenizer