Bir olarak Beyin Microslices arasında excitotoxic uyarılması<em&gt; In vitro</em&gt; İnme Model

Özet

Biz eksitotoksisite kaynaklı beyin hasarı dahil moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilecek bir beyin kesit modeli geliştirdik. Bu teknik açıdan olgun beyin dokusunu oluşturur ve kısmen sağlam nöronal devreleri, hücresel etkileşimleri ve postsinaptik bölmeleri korurken, deney için gerekli olan hayvan sayısı azalır.

Özet

Bütün hayvan sistemlerini kullanırken, iskemik inme gibi nöropatolojik koşullarında yer moleküler mekanizmaları, incelenmesi, zor olabilir. Örneğin, birincil ya da "nöronal benzeri 'hücre kültür sistemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu sistemler, çalışma için nispeten kolay olan ve (örneğin, hücre ölümü gibi) çeşitli işlevsel sonuçlar kolayca belirlenebilir hangi faydalı model sistemleri (örneğin, eksitotoksisite aracılı hücre ölümü yollar gibi) kültürlenmiş olgunlaşmamış nöronlarda muayene sonuçları ve yollar iken zorunlu olgun beyinde gözlenen aynı veya sağlam doku değildir. Bu nedenle, olgun sinir dokuda hücresel mekanizmalar incelenebilir hangi modeller geliştirmek için bir ihtiyaç vardır. Bu sağlam sinir dokusunda moleküler yollarının çeşitli araştırmak için kullanılan bir in vitro teknik geliştirdik. Bu tarifnamede tarif edilen teknik, sıçan kortikal doku kullanır, ancak bu teknik doku kullanmak için adapte edilebilirya da beyin bölgelerinde (örneğin, hipokampus, striatum, vb) (örneğin, fare, tavşan, kobay ve tavuk gibi) türlerin çeşitli. Buna ek olarak, uyarılar / çeşitli tedaviler (örneğin, eksitotoksik, inhibitörlerinin uygulanması, vs) kullanılabilir. Sonuç olarak, burada tarif edilen beyin kesit modeli eksitotoksisite kaynaklı beyin hasarı dahil moleküler çeşitli mekanizmalar incelemek için kullanılabilir.

Giriş

Inme en sık görülen serebral kan damarı tıkalı olduğunda oluşur iskemik inme, olduğunu. Kan akımının kesilmesinden kaynaklanan doku iskemisi membran depolarizasyonunu yaygın uyancı nörotransmitter salınımına neden olur ve hücre ölümünün aktivasyonuna yol açan hücre içi kalsiyum, sürekli yükseklik ¹ yollar yer alır. Bu işlem, "eksitotoksisite" olarak geçecek olan ve inme ² de dahil olmak üzere, çeşitli patolojilerin tarafından üretilen nöronal ölümle ilgili yaygın bir yoludur edilmiştir. Eksitotoksisite ve diğer nöronal hücre ölümü kaskadı dahil olan sinyal yollarının önlenmesi, inme sonrası nöronal hasarı sınırlandırmak için cazip bir yaklaşımdır.

Bütün hayvan sistemlerini kullanırken eksitotoksisite ve iskemik inme dahil kesin moleküler mekanizmaları belirlenmesi zor olabilir. Gibi, primer embriyonik ve 'nöronal-benzeri' (örn. neuroblasto olarakma ve adenokarsinom ölümsüzleştirdi hatları) hücre kültürü sistemleri sıklıkla kullanılır. Bu modellerin temel avantajları, nispeten düşük maliyetli manipüle edilmesi kolaydır ve hücre ölümü kolayca ölçülerek kantifiye edilebilir bulunmaktadır. Ancak, sinyal yolları kültürleme ^3,4 kullanılan koşullar ve olgunlaşmamış nöronlar tarafından değiştirilmiş ve çizgileri farklı reseptörleri ifade ve beyni ^5-8 olgun kıyasla sinyal molekülleri olabilir ölümsüzleştirdi edilebilir. (A kokültürü sistem kullanılırsa, ya da iki) olduğu gibi beyin dokusu birbirleri ile etkileşim hücre tipleri çeşitli içeren, heterojen ise Ayrıca, kültürlü nöronlar, sadece bir hücre tipinin bir inceleme sağlar. Organotipik kesit kültürü sistemleri (beyin dokusu ince dokusu) da kullanılabilir ve bunlar, in vivo olarak bulunanlar gibi bu modeller, heterojen hücre popülasyonlarının çalışma sağlar. Bu tekniği kullanarak, ancak, bir doku sadece sınırlı bir miktarda dilimleri, her hayvandan şekilde elde edilebilirSürece ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri olarak için kültürlenebilir, ve uzun süreli kültürde orta dilim yollarının ve reseptörler ve sinyal değişikliklere neden olabilir değildir. Olgun beyin Organotipik dilimleri üretmek için kullanılabilir iken, olgunlaşmamış beyninden dilim kültüre daha uygun olan ve daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Nöronal sinyal yolları incelenebilir hangi kullanımı kolay olan sağlam olgun beyin, temsil eder ya da taklit eden modeller geliştirmek için bir ihtiyaç vardır.

Burada, bir eksitotoksik veya iskemik zedelenmeden sonra, hücre ölümü ile ilgili moleküler mekanizmaları aydınlatmak için kullanılabilir sağlam sinir dokusu dahil, bir in vitro bir teknik tarif edilmektedir. Bu teknik, bir deney gerçekleştirmek için gerekli hayvan sayısını azaltır, tekrarlanabilir olduğunu, ve daha büyük Organotipik dilimleri için metabolik olarak benzer şekilde davranır canlı doku üretir. Buna ek olarak, nöronal devre, hücre etkileşimleri ve postsinaptik compartment kısmen bozulmadan kalır. Kullanılan fizyolojik tampon hücre 'tekrar kapatılması' için membranların ve sağlayan hücreler kendi özgün membran direncini ⁹ kurtarmak için olanak sağlar. Bu beyin dilim modeli sadakatle eksitotoksikliği bağlı beyin yaralanmaları ¹⁰ aşağıdaki gözlenen tepkiler taklit edebilir, ve inme dahil moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

Protokol

Tüm prosedürler NSW Hayvancılık Araştırma Yasası, NSW Hayvancılık Araştırma Yönetmeliği ve Uygulama için Avustralya Kanunu dahil ilgili kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yanı sıra Newcastle Üniversitesi Hayvan Bakım ve Etik Komitesi onayı ile yapılır Bakım ve Bilimsel Amaçlı Hayvan kullanımı.

1.. Beyin Doku diseksiyonu

1. Başları kesilerek on iki haftalık erkek fareleri kurban. Sıçanlar ya da çarpıcı ve başları kesilerek feda edilebilir ya da ilk izofluran (% 5 indüksiyon,% 1.5-2 bakım)% 70 _N2 ve% 30 _O2 ile anestezi edilmesi ve daha sonra başları kesildi.
2. Mümkün olduğunca hızlı kafatası beyin kaldırmak (ideal, bu az 2 dakika içinde yapılmalıdır).
3. Serbest el diseksiyon ile korteks kaldırmak. Mai şekilde diseksiyon mümkün beyne az hasar ile, mümkün olan en kısa sürede yapılmalıdırdilim bütünlüğünü ntain.
4. Herhangi bir artık deri kaldırmak için, vs kürk, kan, 37 ° C'de Krebs tamponu (118 mM sodyum klorid, 4.7 mM potasyum klorür, 1.3 mM kalsiyum klorür, az miktarda (3-5 mi) içinde beyin batırmak 1.2 mM potasyum dihidrojen fosfat, 1.2 mM magnezyum sülfat, 25 mM sodyum hidrojen karbonat, 11.7 mM glikoz, 0.03 mM disodyum etilendiamin tetraasetik asit (EDTA),% 95 oksijen /% 5 karbon dioksit (karbojen), pH 7.4) ile dengelenmiştir.

2. Microslices hazırlanması

1. Filtre kağıdı iki dilim yerleştirilir ve sıcak Krebs tamponu ile nemlendirilmiş hangi bir McIlwain helikopter sahnede beyin yerleştirin. Beyin ve sıcak Krebs tamponu ile ıslatılmış filtre kağıdı Ol, ama çok ıslak olmayan beyin etrafında kaymasına neden olabilir kağıdın yüzeyinde serbest sıvı olduğu.
2. 250 mikron koronal bölüme beyin dilimleyin. Besin, oksijen ve atık maddeler inci gibinormal olarak kan dolaşımı izole edilmiş sinir dokuda dokuyu saran bir sıvı ile değiştirilir ile değiştirilir de, dilimlerin büyüklüğü yeterli oksijen ve besin alışverişi yapılmasına izin vermek kalınlığı 400 um 'den fazla olmamalıdır.
3. McIlwain evre 90 ° çevirin.
4. 250 mikron sagital dilimlere beynini dilimleyin. Burada, bu beyin kesitleri (değişken uzunlukta, 250 um x 250 um dilimleri dokusunun kalınlığına bağlı olarak) microslices olarak adlandırılır.
5. (El Krebs tampon miktarı doku miktarına bağlıdır) 10-15 ml 37 ° C Krebs tamponu ile bir yuvarlak tabanlı tüp içine microslices yerleştirin.

3. Microslices ekilibre

1. Yavaşça bireysel microslices askıya kadar ajitasyon, ve sonra onları yerçekimi altında yerleşmek için izin verir.
2. Dikkatle nedeniyle askıya hücre enkaz bulutlu olacak, süpernatant kaldırmak ve taze 37 ° C 10 ml ekleyinKrebs tampon tüpüne.
3. Enkaz çoğunluğunun çıkarılması ile sonuçlanacaktır ki, bu yıkama işlemi dört kez tekrarlayın.
4. Bunu takiben, nazik sallama / ters ile, 37 ° C'de dengeye microslices, ve Krebs, toplam 1 saat boyunca her 15 dakikada bir tampon değiştirin.
5. Bu anda, 2 ml taze 37 ° C Krebs tampon ekleyin ve düz dipli polistiren 15-20 microslices (microslice süspansiyonu 150 ul) aktarmak tarafından oluşturulabilir yumuşatılmış kenarları (ile ekstra geniş çaplı bir pipet kullanarak 5 ml tüpler P1000 ucunun ucundan ~ 2 mm kesme). Her microslice oksijenli atmosfere bir kaç milimetre daha fazla değildir, böylece, tek kat olarak borunun tabanı üzerinde eşit microslices yayın.

4. Excitotoxic Stimülasyon

1. 37 ° C'de inkübe microslices ve sürekli pozisyonu olan bir gaz hattı kullanarak, 150 ul microslice süspansiyon yüzeyi üzerine geçmek karbojensadece microslice süspansiyonuna (mekanik aksamasını önlemek için) yüzeyinin üstünde ed.
2. (: Nihai konsantrasyon 2.5 mM glutamat + 50 uM glisin eksitotoksik uyarıcı) ya da tek başına 150 ul Krebs tamponu (Stimülasyon kontrol) 150 ul 5 mM glutamat + 100 Krebs tamponu içerisinde uM glisin ile ya microslices tedavi. Çeşitli uyaranlara bu aşamada kullanılabilir (de dahil olmak üzere, ancak bunlarla sınırlı değildir, AMPA, NMDA + glisin, KCl depolarizasyon ve oksijen / glikoz yoksunluğu).
3. Çeşitli zamanlarda post-stimülasyonu (0, 30, 60, 90, 120 ve 300 saniye) de inkübasyon çözüm çıkarın ve buz soğukluğunda homojenizasyon tampon maddesi (30 mM Tris, pH 7.4, 1 mM etilen glikol içinde 300 ul ile değiştirin tetraasetik asit, 4 mM EDTA, 100 uM amonyum molibdat, 5 mM sodyum pirofosfat, 25 mM sodyum fluorür, 1 mM sodyum ortovanadat, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride, adet tam proteaz inhibitör kokteyli).
4. Bir cam-Teflon Dounce Homojenizatörü kullanılarak, buz üzerinde homojenize microslices(20 vuruş, 700 rpm).
5. Gibi -80 ° C arasında ve çeşitli sinyal verici moleküllere, ölüm moleküller saklayın homojen western blot ile ölçülebilir.

Sonuçlar

Bu prosedür kullanılarak üretilen Microslices uygun olan ve çeşitli türlerin (örneğin, sıçan, fare ve tavuk) microslices üretmek için kullanılabilir. Canlılığı üç bağımsız tedbirler faydalanılmıştır: solunum oranı (Şekil 1), adenin nükleotid oranları (Şekil 2), ve doku potasyum içeriği (Şekil 3). Bu önlemleri kullanarak, microslices en az 2 saat sonrası kuşak için geçerli kalır ortaya konmuştur.

Brain...

Tartışmalar

Burada, sağlam olgun beyin dokusunda eksitotoksisite ve iskemiye bağlı hücre ölümü ile ilgili moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir microslices üretilmesi için bir in vitro bir teknik tarif edilmektedir. Bu teknik, uygun bir doku (Şekil 1-3), yani daha büyük bir Organotipik dilimleri ¹⁵ metabolik benzer üretir. Ayrıca, bu microslice modeli yakından vivo ¹⁰ eksitotoksisite kaynaklı beyin hasarı aşağıdaki gözlenen te...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Guillotine			Used to decapitate animal
Surgical equipment			Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection
McIlwain chopper	McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella.		Used to generate 100-400 µm brain sections.
Round bottom plastic tubes	Greiner
Water bath			For keeping tissue at 37 °C
Humidifier/aerating apparatus			Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment
Flat bottomed polystyrene tubes	Nunc
Dounce Homogenizer