Экзайтотоксическим Стимуляция мозга Microslices как<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель инсульта

Резюме

Мы разработали модель ломтик мозга, который может использоваться для изучения молекулярных механизмов, участвующих в эксайтотоксичность опосредованной травмы головного мозга. Этот метод генерирует жизнеспособной зрелой ткани мозга и уменьшает количество животных, необходимых для экспериментов, в то время как сохранение нейронной цепи, клеточных взаимодействий и постсинаптические отсеков частично нетронутыми.

Аннотация

Изучение молекулярных механизмов, участвующих в нейропатологических условиях, таких как ишемического инсульта, может быть трудно при использовании целые системы животных. Таким образом, первичный или "нейронов-подобные 'системах клеточных культур, как правило, используется. В то время как эти системы могут быть сравнительно легко работать, и являются полезными модельные системы, при которой различные функциональные результаты (например, гибели клеток) могут быть легко количественно, исследованные результаты и пути в культуре нейронов незрелых (например, эксайтотоксичность-опосредованной клеточной гибели путей) не обязательно те же, что наблюдается в зрелом мозге или в интактной ткани. Таким образом, существует необходимость в разработке модели, в которых клеточные механизмы в зрелом нервной ткани может быть рассмотрен. Мы разработали методику в пробирке, которую можно использовать, чтобы исследовать различные молекулярные пути в интактной нервной ткани. Методика использует описанные здесь ткани коры головного мозга крыс, но этот метод может быть адаптирован для использования тканииз различных видов (например, мыши, кролика, морской свинки, и курицы) или областях мозга (например, гиппокамп, стриатума и т.д.). Кроме того, разнообразие стимуляции / лечения можно использовать (например, эксайтотоксический, введение ингибиторов и т.д.). В заключение, модель мозг ломтик описано здесь, может быть использован для изучения различных молекулярных механизмов, участвующих в эксайтотоксичности-опосредованного повреждения головного мозга.

Введение

Наиболее распространенной формой инсульта ишемического инсульта, который происходит, когда мозговой кровеносных сосудов становится окклюзии. Ткань ишемии, который возникает в результате прекращения кровотока приводит к широкому деполяризацию мембраны, высвобождение возбуждающих нейромедиаторов, и устойчивое повышение внутриклеточного кальция, что приводит к активации пути клеточной гибели ^1. Этот процесс был назван "эксайтотоксичность ', и является общим путь вовлечен в гибели нейронов производится с помощью различных патологий, в том числе инсульта ^2. Ингибирование сигнальных путей, участвующих в эксайтотоксичности и других нервных каскадов клеточной гибели является привлекательным подход ограничить повреждения нейронов после инсульта.

Выявление точные молекулярные механизмы, участвующие в эксайтотоксичности и ишемического инсульта может быть трудно при использовании целые системы животных. По существу, первичной эмбриональных и "нейронов, как '(например neuroblastoма и аденокарциномы иммортализованные линии) системы клеточных культур часто используются. Основные преимущества этих моделей в том, что они легко манипулировать, относительно экономически эффективным, и гибель клеток может быть легко измерены и количественно. Тем не менее, сигнальные пути могут быть изменены условий культивирования, используемых ^3,4 и незрелых нейронов и увековечен линии могут экспрессировать различные рецепторы и сигнальные молекулы по сравнению с зрелые мозг ^5-8. Кроме того, культивируемые нейроны только позволит рассмотрение одного типа клеток (или два, если используется система совместного культивирования), тогда как неповрежденной ткани мозга неоднородна, содержащие различные типы клеток, которые взаимодействуют друг с другом. Органотипической системы культуры ломтик (тонкие эксплантатах мозговой ткани) также используются, и эти модели позволяют изучение гетерогенных популяций клеток, поскольку они находятся в естественных условиях. Тем не менее, лишь ограниченное количество ткани можно получить от каждого животного при использовании этого метода, ломтики можетне быть культивированы так долго, как иммортализованных клеточных линий, и от среднего до долгосрочного культуры могут привести к изменениям в сигнальных путей и рецепторов в срезах. В то время как пожилые мозг может быть использован для создания органотипической ломтики, кусочки от незрелого мозга более склонны к культуре, и более широко используется. Существует, следовательно, необходимость в разработке моделей, которые имитируют или представляют нетронутыми зрелый мозг, что просты в использовании, в котором нейронные сигнальные пути могут быть рассмотрены.

При этом техника в пробирке с участием нетронутыми нервной ткани, которую можно использовать для выяснения молекулярные механизмы, участвующие в клеточной смерти после эксцитотоксического или ишемического инсульта описано. Этот метод уменьшает количество животных, необходимых для выполнения эксперимент, воспроизводим и генерирует жизнеспособной ткани, которая ведет себя в метаболически аналогично больших органотипических ломтиками. Кроме того, нейронная схема, сотовые взаимодействия, и постсинаптического соmpartment остается частично нетронутыми. Физиологическая буфер, используемый позволяет клеточные мембраны "запечатать", а также позволяет клеткам восстановить свой ​​первоначальный сопротивление мембраны ^9. Эта модель мозга срез способен добросовестно имитировать ответов наблюдаемые следующие эксайтотоксичность опосредованной травмы головного мозга ^10, и может быть использован для изучения молекулярных механизмов, участвующих в ход.

протокол

Все процедуры проводятся с одобрения Университета Ньюкасла уход за животными и комитета по этике, а также в соответствии с соответствующими принципами и правилами, в том числе Закона о NSW исследований на животных, животное исследовательского регулированию NSW, и австралийский Кодекса практики Уход и использование животных в научных целях.

1. Рассечение ткани головного мозга

1. Жертвоприношение двенадцати недельных крыс мужского пола путем обезглавливания. Крысы могут быть либо умерщвляли потрясающий и обезглавливания, или может быть первым наркозом изофлураном (5% индукции, 1,5-2% технического обслуживания) в 70% N ₂ и 30% О _2, а затем обезглавили.
2. Удалить мозг от черепа как можно быстрее (в идеале это должно быть выполнена менее чем за 2 мин).
3. Снимите кору на свободной рукой рассечение. Рассечение должны быть выполнены в возможно кратчайший срок, с минимальным повреждением мозга, как это возможно, с тем чтобы МАИntain целостность ломтиками.
4. Для того чтобы удалить остатки кожу, мех, крови и т.д., погружают в мозг в небольшом количестве (3-5 мл) 37 ° C буфера Кребса (118 мМ хлорида натрия, 4,7 мМ хлористый калий, 1,3 мМ хлорида кальция, 1,2 мМ дигидрофосфат калия, 1,2 мМ сульфат магния, 25 мМ бикарбоната натрия, 11,7 мМ глюкозы, 0,03 мМ динатриевой этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), уравновешенную 95% кислорода / 5% диоксида углерода (карбоген), рН 7,4).

2. Подготовка Microslices

1. Поместите мозг на сцене измельчитель McIlwain, на котором два ломтика фильтровальной бумаги были размещены и смоченной теплой буфера Кребса. Держите мозг и фильтровальную бумагу, смоченную теплой буфера Кребса, но не настолько влажным, что есть свободная жидкость на поверхности бумаги, которые могут вызвать мозг скользить вокруг.
2. Нарежьте мозг в 250 мкм корональных секций. Как питательные вещества, кислород, и отходы йна которые обычно обменивается с кровоснабжение обмениваются с жидкостью, которая окружает ткани в изолированной нервной ткани, размеры слоев не должно быть более чем 400 мкм в толщину, чтобы обеспечить адекватное насыщение кислородом и питательными веществами обмен происходит.
3. Превращает сцену McIlwain 90 °.
4. Нарежьте мозги в 250 мкм сагиттальной ломтиками. В данном случае эти срезы головного мозга (250 мкм × 250 мкм срезы переменной длины в зависимости от толщины ткани), называют microslices.
5. Поместите microslices в круглую нижнюю трубу с 10-15 мл 37 ° C буфера Кребса (количество буфера Кребса использовать, будет зависеть от количества ткани).

3. Сбалансированность Microslices

1. Осторожно перемешивают до индивидуальных microslices не приостановлены, а затем позволить им поселиться под действием силы тяжести.
2. Осторожно удалите супернатант, который будет облачно из-за взвешенных мусора клеток, и добавить 10 мл свежевыжатого 37 ° СБуфер Кребса к трубе.
3. Повторите Эту процедуру промывки четыре раза, что приведет к удалению большей части мусора.
4. После этого уравновешивания microslices при 37 ° С при осторожном встряхивании / инверсии, а также изменить буфера Кребса каждые 15 мин в течение 1 часа в общей сложности.
5. В это время добавляют 2 мл свежего буфера 37 ° C Кребса, и передавать 15-20 microslices (150 мкл microslice суспензии) к плоским дном полистирола 5 мл трубы с помощью дополнительного широким отверстием пипетки со сглаженными краями (которые могут быть созданы путем резка ~ 2 мм от конца наконечника P1000). Распространение microslices равномерно по дну трубки в одном слое, так что каждый microslice не дальше чем на несколько миллиметров от кислородом атмосфере.

4. Экзайтотоксическим Стимуляция

1. Инкубируйте microslices при 37 ° С и непрерывно проходить карбогена над поверхностью 150 мкл суспензии microslice, используя газовую линию, которая положениеред чуть выше поверхности microslice суспензии (во избежание механического разрушения).
2. Лечить microslices либо 150 мкл 5 мМ глутамата + 100 мкМ глицина в буфера Кребса (эксайтотоксический стимул: конечная концентрация 2,5 мМ глутамат + 50 мкМ глицина) или 150 мкл Кребса только буфера (контроль нестимулированных). Различные раздражители могут быть использованы на этом шаге (в том числе, но не ограничиваясь этим, AMPA, NMDA + глицин, KCl деполяризация, а кислород / глюкоза лишение).
3. Удалите инкубационный раствор в различные моменты времени после стимуляции (0, 30, 60, 90, 120 и 300 сек), и заменить его 300 мкл охлажденного льдом буфера гомогенизации (30 мМ Трис, рН 7,4, 1 мМ этиленгликоль тетрауксусной кислоты, 4 мМ ЭДТА, 100 молибдат аммония мкМ, 5 мМ пирофосфата натрия, 25 мМ фторида натрия, 1 мМ ортованадат натри, 1 мМ phenylmethanesulfonylfluoride, полный коктейль ингибитора протеазы).
4. Гомогенизируют microslices на льду, используя стекло-тефлон Dounce гомогенизатор(20 ударов; 700 оборотов в минуту).
5. Магазин гомогенатах при -80 ° С, и различных сигнальных молекул, молекул смерти и т.д. можно измерить с помощью вестерн-блоттинга.

Результаты

Microslices, полученные с использованием этой процедуры являются жизнеспособными, и разнообразие видов (например, крысы, мыши и курицы) могут быть использованы для получения microslices. Три независимых меры жизнеспособности были использованы: частота дыхания (рис. 1), аденин нуклеотидны...

Обсуждение

При этом пробирке метод в для генерации microslices которые могут быть использованы для изучения молекулярные механизмы, вовлеченные в эксайтотоксичности и ишемии-опосредованной гибели клеток в интактной ткани головного мозга зрелого описано. Эта техника производит жизнеспособ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Guillotine			Used to decapitate animal
Surgical equipment			Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection
McIlwain chopper	McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella.		Used to generate 100-400 µm brain sections.
Round bottom plastic tubes	Greiner
Water bath			For keeping tissue at 37 °C
Humidifier/aerating apparatus			Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment
Flat bottomed polystyrene tubes	Nunc
Dounce Homogenizer