新生儿软脑膜表面电穿孔

摘要

软脑膜表面是受到越来越多的关注，在中枢神经系统的唯一祖区。在此，我们详细为这个祖区使用改进的电穿孔法快速基因操作的方法。此过程可用于细胞和分子细胞谱系及参与细胞分化信号通路的调查，并阐明子细胞的命运和属性。

摘要

在过去的几年中软脑膜表面已被确定为重要的生发利基胚胎，围产期和成年神经和gliogenesis期间，包括伤后。然而，对于基因询问这些祖人口和跟踪他们的谱系方法已经由于缺乏特异性或耗时的生产病毒的限制。因此，在该区域的进展一直只有少数这个位置的调查相对较慢。在出生后的大脑电已经使用了十多年，研究在胚胎神经干细胞的特性，以及最近。这里我们描述了一种高效，快速和简单的技术的基础上适合电穿孔的方法软膜表面祖细胞的遗传操作。软膜表面电允许这些祖细胞的浅显遗传标记和操纵，从而代表为研究这些细胞的一个省时省力又经济的方法。

引言

神经干细胞和祖细胞是存在于整个哺乳动物CNS ^1，2。它们的性质和在周围的脑和脊髓的脑室区域胚胎和成年生发区属性已被广泛地记载在过去的十年中^1-3。在很大程度上，这是由于越来越精确的遗传工具，如两侧装接loxP等位基因或逆转录病毒谱系追踪⁴的神经系统特异性表达Cre重组的发展。然而，一个祖区域软脑膜表面祖区，最近才在任何细节^5-7被描述并等待全面的检查。

脑的软膜表面被定义为在脑表面和周围脑膜⁸之间的界面。在发育过程中，神经上皮，以及后来的放射状胶质年底脚连接到这个表面^9,10。有些杉木ST的神经元在人脑和神经细胞的多丝分裂在此区域¹¹的观察。后来，在胚胎神经，皮质的interneurons被称为遍历软脑膜地区，除了在中间区和脑室下区^12-14它们的迁徙路线。在此期间，干细胞可以从该区域中进行培养，它似乎是神经和gliogenesis ⁵的活性位点。在成人大脑，它已经报道的interneurons可以从软脑膜表面祖细胞缺氧的挑战⁷诞生。然而，该地区对他的胚胎和出生后发育过程中genensis的贡献由于专门调查这一区域⁶的难度依然晦涩的部分。在上丘和在大脑皮质，表面（或层我在皮层）的interneurons可以调节下层兴奋性神经元群体的电路的输出，从而有助于significantly这些结构的功能。特别是，第1层的interneurons在首要的位置，调节神经元的整定其广泛的连接性皮质列^15,16的浅表和深部层大脑皮层的上层射击。以类似的方式，水平的interneurons接受兴奋性输入从皮 ​​质和视网膜纤维，项目在相对 ​​宽的区域，并推测介导的抑制神经元群体响应远程视觉刺激^17,18的。另外，其形态是非常适合于在显影视觉系统¹⁹中的图案化波活动中发挥潜在作用。有趣的是，interneuron发育和成熟发生很大程度出生后。另外，该成熟过程中已经发现，通过神经细胞的活动进行调节，因此对电路功能^20,21终身后果发育可塑性的基板。值得注意的是，正Ø促销员的描述，可以专门针对这些细胞植入基因。除以祖细胞可以靶向与逆转录病毒^7，但病毒产量是耗时并需要技巧，得到所需要的细胞转导的高滴度。

电穿孔导致了文艺复兴时期的神经发育的研究，因为它允许在神经祖细胞^4，22，23信号通路的快速，高效的基因审讯。电穿孔涉及到注射的质粒DNA，随后递送电脉冲的头部的外侧，以单向驱动DNA导入周围的脑室^4，22，23的增殖祖细胞。电显示通过细胞周期进行质粒的转基因²⁴的表达M期，要求细胞的转运。具体而言，已经发现，只细胞通过内质粒电穿孔的8小时M期会表达外源基因，尽管他们有效地提供心室壁²⁴的所有细胞内〜160微米。据推测，这是由于需要为核膜破裂在允许的附加 ​​型质粒的核设施，如化学品导致的核通透性能诱导后有丝分裂细胞²⁵质粒的表达。最初受聘于胚胎^22，电穿孔，是深受²⁶后^，27适于用在出生后大脑。最近，我们已经适应了电穿孔的在软脑膜表面祖⁶遗传操作使用。此外，使用这种方法，我们已经表明，有明显的祖细胞的两个不同细胞系中此区域的元间和星形细胞^6。该协议详细介绍了简单，快速，强大的方式来针对这些细胞进行审讯这些细胞的机制调节发展。

研究方案

这个程序是按照雪松 - 西奈IACUC要求。调查人员应当确保机构IACUC符合前程序。所有工具和试剂应当在使用前灭菌。

1，工具的准备，解决方案和DNA混合物

1. 将100毫米火抛光的高硼硅玻璃毛细管成微量拉马。设置加热，以允许标准加权拉以形成约17.5毫米枪头。用锋利的手术剪刀的技巧在距离约8-9毫米的尖端开始，以创造大约100微米直径的开口。
2. 做一只股票1％w / v的快速绿色解决方案，用干燥快绿混合过滤，无核酸酶水（利用20微米注射器过滤器）。
3. 分离纯化的无内毒素的质粒DNA是高度浓缩的（ 即 > 3微克/微升），稀释在Tris-EDTA（TE）缓冲液中。质粒加入所需量的向混合物稀释于TE缓冲液中，并加入1:10的比例在1％固绿溶液（使0.1％w / v的快速绿色最终浓度）。使用质粒的0.5-2.0微克/微升终浓度为转基因的强劲表现。

2，动物麻醉，移液器加载和软脑膜表面质粒注射

1. 通过将它们放在一个培养皿中被置于冰上5-8分钟（时间取决于小狗年龄/体重）诱导低温麻醉在1-2天出生后的小鼠。一旦体温是由缺乏从脚趾捏和/或尾部反射运动的证实，老鼠是准备注入。将动物背冰上如果疼痛反射是显而易见的。注射过程和电需要不到2-3分钟的总时间如此之低体温，注射和电穿孔程序，从而保持适当的麻醉。
2. 在麻醉过程中，使用的是标准的移液管，移液管仔细所需plasmi量ð混合拟注入（0.5-2微升）到一块石蜡膜以供参考。这里，0.5微升质粒混合物的总体积被注入。接着，用微型注射器，小心地插入装配玻璃毛细吸管到含有管质粒混合物。采取额外的预防措施，以防止尖端的断裂通过确保它不触及管的边缘。通过慢慢地拨打背面转印拨盘吸出溶液进入吸管。一旦足够量的已被加载到移液管，转盘前进，直到压力恢复到0帕斯卡中立位置。
3. 使用300-450百帕压力注射，以确保适当的压力，即使填充软脑膜表面/脑膜空间，将附近的移液石蜡电影基准注射液（2.2）的尖端，并使用脚踏板从微量进样器弹出的一个卷到石蜡膜。相应地调整压力，直到排出量等于先前吸管referencË量。
4. 一旦前端已平衡和麻醉已被证实，幼仔已准备好进行注射。
5. 该实验的目的是在颅骨和上面的软膜表面的质粒混合物注入到向下允许用于DNA电穿孔进入软脑膜表面祖细胞（ 图1A）。对于皮质注射，用拇指和食指少占主导地位的手按住小狗下来。皮质半球和其他表面结构，如优良丘是P0和P2之间的可见光，允许这些结构（ 图1B）的轻便定位。使用皮质的惯用手和目标所需的区域（ 即电机，体感等），插入吸管过去的皮肤和颅骨照顾，以避免脑动脉。一定要防止过去的头骨（这是刚刚刺入颅骨后，表示因缺乏进一步阻力）尖端的进一步渗透。
6. 血浆注入使用ID解决方案的微量进样器的脚踏板，并确保其均匀地分散在整个组织中（ 图2A）。
   注意：根据经验确定最大化质粒递送，同时避免血肿由于流体压力的方法是非常重要的。这可以通过调整喷射的持续时间，角度，体积，精确的靶位点，以避免血管破​​裂来完成。
7. 一定要尝试，并从蜡纸或塑料薄膜石蜡先前作出的注射将尖端测试液滴保持尖端的注射之间的干燥。这是必需的，以防止蒸发和crystalized DNA溶液，从而导致在针尖和不一致的交货量的堵塞的末端积累。

3，电穿孔

1. 设定电穿孔至135-150 V为5个脉冲，持续50毫秒，以950毫秒的间隔中的每个脉冲之间。为了提高电导率和防止皮肤的烧灼，盖3毫米铂tweezertrodes与电穿孔凝胶。检查脚趾捏和尾部反射在这一点上，以确保麻醉。如果响应，放置在冰上几分钟至麻醉。
2. 为皮层（和上丘）注射液，采用3毫米电极（ 图2B），以增加幼仔的存活率（与7相比-和10 -毫米的电极，这是用于脑室区电穿孔）。将带负电荷的探针上的电极在注入区和带正电的探针在眼部周围，例如下面的对侧区域，该电极取向是在45-60°的角度相对于所述中线（ 图2C）一个。
3. 占曲率时，使用电穿孔的踏板触发电流和保持tweezertrodes到位3-5脉冲，根据小狗的年龄和体重，有效地靶向DNA插入下层软脑膜细胞表面半球的。
   注意：该负极可以扫过喷射区域中的脉冲或一个较大的电极可以被用来增加电穿孔区域之间。
4. 立即电后，仔细擦去凝胶从幼崽，并将其放置在约5分钟加热灯。
5. 幼仔会敏锐地失去其自然的红色，粉红色的色调在电由于后发绀分钟。他们回到自己的笼子前，观察仔兔的自然颜色和正常运动的开始复苏。
6. 确保与母亲再社会化，通过观察她是否带回巢中的幼崽，并开始培养他们。如果她变得咄咄逼人，确保幼崽没有凝胶的残余，并培育他们与一些床上用品的气味转移到幼崽。

4，修改为瞄准高级丘

目标：

1. 麟蹄克拉上丘中相同的方式皮层但是注意，目标区域位于正后方和侧方的λ和大致在中线（ 图3A和3B）。与成功的注射剂，所述质粒组合自然填充上丘的轮廓。一旦注射已成功，动物是准备好电。

电穿孔：

1. 在一个非常类似的方式，对上丘注射，将带负电荷的探针上的电极在注入区和眼部周围，吻或颏带正电的探头，驱动源DNA插入上丘的浅表区域（ 图3C） 。在这种情况下，电极的方向是在25-40°的角度相对于所述中线一个。

结果

软膜表面电穿孔结果中质粒DNA的细胞中，主要是祖细胞，在室温或接近软脑膜表面⁶的表达。更具体地，所述电极的定向是在听写质粒运动和随后的表达式的方向是至关重要的。因此，在双电极配置，该质粒被定向在负和正电极之间的大致的直矢量。因此，如果负极放置在注射部位和正极是腹侧向负极，质粒将被压入软膜表面。假定定向的电极以产生电流矢量垂直于表面将是非常理想的。?...

讨论

对软脑膜表面祖成功电穿孔的最关键方面是：1）靶向质粒组合到软脑膜表面; 2）避免血肿​​的发生在注射部位; 3）避免与电脑相关的死亡率。

适当地靶向软脑膜表面由头骨测量和小心刺入完成，以避免软膜表面的渗透。 1）位移后轻轻揉组织（ 即快绿是在皮肤和结缔组织头骨上面的本地化）的快速绿色染料与皮肤：针对不当上覆皮肤或基础脑室或脑实质将由证明或2...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fire Polished Borosilicate Tubing	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Micropipette Puller	Sutter Instruments Company	P-30
Fast Green FCF	Sigma Aldrich, Inc.	F7528
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments Company
ECM 830 Generator	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0052
3-mm Platinum Tweezertrodes	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0487
SignaGel Electrode Gel	Cardinal Health	70315-025
Tris-EDTA Buffer, pH 8.0	Integrated DNA Technologies, Inc.	11-01-02-05
Infrared Heat Lamp	VWR	36547-009
Fine Scissors Sharp	Fine Science Tools	14060-09