Neonatale Pial elettroporazione Surface

Riepilogo

La superficie piale è una zona progenitore unico nel SNC che sta ricevendo crescente attenzione. Qui, noi dettaglio un metodo per la manipolazione genetica rapido di questa zona progenitore utilizzando un metodo di elettroporazione modificato. Questa procedura può essere utilizzata per indagini cellulari e molecolari delle linee cellulari e vie di segnalazione coinvolte nella differenziazione cellulare e per chiarire il destino e le proprietà delle cellule figlie.

Abstract

Negli ultimi anni la superficie piale è stato identificato come una nicchia germinale di importanza durante embrionale, perinatale e adulti neuro-e gliogenesi, compreso dopo l'infortunio. Tuttavia, i metodi per interrogare queste popolazioni geneticamente progenitrici e monitoraggio le loro linee erano limitate a causa della mancanza di specificità o tempo di produzione di virus. Così, i progressi in questa regione è stato relativamente lento con solo una manciata di ricerche di questa posizione. L'elettroporazione è stato utilizzato per oltre un decennio a studiare neurali proprietà delle cellule staminali nell'embrione, e più recentemente nel cervello postnatale. Qui si descrive una tecnica efficiente, rapido e semplice per la manipolazione genetica dei progenitori superficie piale basati su un approccio elettroporazione adeguato. Pial superficie elettroporazione consente per l'etichettatura genetica facile e manipolazione di questi progenitori, rappresentando così un approccio risparmio di tempo ed economico per lo studio di queste cellule.

Introduzione

Cellule staminali e progenitrici neurali sono presenti in tutta la loro SNC ^{1, 2.} La loro natura e le proprietà nelle zone germinali embrionali e adulte che circondano le regioni ventricolari del cervello e del midollo spinale sono stati ampiamente documentati negli ultimi dieci anni ^1-3. In gran parte, ciò è dovuto allo sviluppo di strumenti genetici sempre più precisi, come il sistema nervoso specifico Cre ricombinazione degli alleli floxed e lignaggio retrovirale tracciamento ^4. Tuttavia, una regione, il progenitore piale progenitore superficie di zona-ha solo stato recentemente descritto in dettaglio ^5-7 e attende esame completo.

La superficie piale del cervello è definito come l'interfaccia tra la superficie del cervello e meningi circostanti ^8. Durante lo sviluppo, neuroepiteliale e, più tardi, i piedi end gliali radiali attribuiscono a questa superficie ^9,10. Alcuni di abetest neuroni nel cervello umano e molte mitosi neuronali si osservano in questa regione ^11. Successivamente, durante la neurogenesi embrionale, interneuroni corticali sono noti per attraversare la regione piale, oltre alla loro rotte migratorie nella zona intermedia e zona subventricular ^12-14. Durante questo periodo, le cellule staminali possono essere coltivate da questa zona e sembra di essere un sito attivo di neuro-e gliogenesi ^5. Nel cervello adulto, è stato riportato che interneuroni possono nascere da progenitori superficie piale seguente sfida ipossica ^7. Tuttavia, il contributo di questa regione al suo a genensis durante lo sviluppo embrionale e postnatale è rimasta oscura in parte a causa della difficoltà di specificamente indagare questa regione ^6. In collicolo superiore e nella corteccia cerebrale, interneuroni superficiali (o layer I nella corteccia) possono modulare l'uscita del circuito di sottostanti popolazioni neuronali eccitatori e contribuire così significativaantly alla funzione di queste strutture. In particolare, lo strato 1 interneuroni sono in posizione privilegiata per regolare la scarica dei neuroni durante strati superiori della corteccia cerebrale data la loro ampia connettività agli strati superficiali e profondi di colonne corticali ^15,16. In modo simile, gli interneuroni orizzontali ricevono input eccitatorio da fibre corticali e retiniche, progetto su un'area relativamente ampia e sono speculato per mediare l'inibizione di popolazioni di neuroni che rispondono a stimoli visivi remoto ^17,18. Inoltre, la loro morfologia è adatto a svolgere un ruolo potenziale nell'attività onda modellata nel sistema visivo di sviluppo ^19. È interessante notare che lo sviluppo degli interneuroni e maturazione avviene in larga misura dopo la nascita. Inoltre, questo processo di maturazione è stato trovato per essere regolata da attività neuronale ed è quindi un substrato di plasticità dello sviluppo con conseguenze per tutta la vita sulla funzione del circuito ^20,21. In particolare, no promotori sono descritti che possono specificatamente indirizzare queste cellule transgenically. Progenitori dividono possono essere mirati con retrovirus ^7, ma la produzione di virus è in termini di tempo e richiede abilità per ottenere i titoli elevati necessari per la trasduzione delle cellule.

Elettroporazione ha portato ad una rinascita nello studio di neurosviluppo in quanto consente una rapida ed efficace interrogatorio genetica delle vie di segnalazione in progenitori neurali ^{4, 22, 23.} Elettroporazione comporta l'iniezione di DNA plasmidico, seguita dal rilascio di impulsi elettrici al di fuori della testa, per guidare unidirezionalmente il DNA nei progenitori proliferanti circondano i ventricoli ^{4, 22, 23.} Elettroporazione sembra richiedere transito delle cellule attraverso fase M del ciclo cellulare per l'espressione dei transgeni plasmide ^24. In particolare, si è scoperto che solocellule di passaggio di fase M entro 8 ore di elettroporazione di plasmidi esprimeranno transgeni nonostante una consegna efficace per tutte le celle all'interno di ~ 160 micron della parete ventricolare ^24. Si dice che questo è dovuto alla necessità di ripartizione involucro nucleare nel consentire l'accesso nucleare dei plasmidi episomale, come sostanze chimiche che provocano permeabilizzazione nucleare possono indurre l'espressione di plasmidi in cellule post mitotiche ^25. Originariamente impiegato nell'embrione ^22, elettroporazione è stato adattato per l'uso nel cervello postnatale molto più tardi ^{26, 27.} Recentemente, abbiamo adattato elettroporazione per l'uso nella manipolazione genetica di progenitori superficie piale ^6. Inoltre, con questo metodo abbiamo dimostrato che ci sono apparentemente due linee distinte di progenitori in questa regione-interneuronale e astrocitaria ^6. Dettagli Questo protocollo un modo semplice, rapido e potente per indirizzare queste cellule per l'interrogazionelo sviluppo di meccanismi di regolazione di queste cellule.

Protocollo

Questa procedura è in conformità con i requisiti Cedars-Sinai IACUC. Gli investigatori dovrebbero garantire l'osservanza IACUC istituzionale prima di procedere. Tutti gli strumenti ei reagenti devono essere sterilizzati prima dell'uso.

1. Preparazione di strumenti, soluzioni, e la miscela di DNA

1. Inserire borosilicato lucido tubi capillari di vetro da 100 mm di fuoco in un estrattore micropipetta. Impostare il riscaldamento per consentire tirare ponderata standard per formare la punta di pipetta di circa 17,5 millimetri. Tagliare le punte con forbici chirurgiche taglienti ad una distanza di circa 8-9 mm dall'inizio della punta per creare un'apertura circa 100 micron di diametro.
2. Fare un magazzino 1% w / v soluzione verde veloce mescolando acqua priva di nucleasi filtrato (utilizzando un filtro a siringa da 20 micron) con verde veloce asciutto.
3. Isolare purificato privo di endotossine DNA plasmide che è altamente concentrato (cioè> 3 mg / mL), diluito in Tris-EDTA (TE) buffer. Importi aggiungere desiderate di plasmidedi miscela diluita in tampone TE e aggiungere un rapporto 1:10 della soluzione verde veloce 1% (per un 0,1% w / v concentrazione finale di verde veloce). Utilizzare una concentrazione finale di 0,5-2,0 mg / mL di plasmide per la robusta espressione dei transgeni.

2. Anestesia animale, Pipetta Caricare, e Pial superficie plasmidi iniezione

1. Indurre l'anestesia ipotermia in 1-2 giorni topi postnatale mettendoli su un piatto di Petri che viene inserito sul ghiaccio per 5-8 minuti (il tempo dipende dall'età pup / peso). Una volta che l'ipotermia è confermato dalla mancanza di da-punta pizzicamento e / o di coda riflesso movimento, i topi sono pronti per essere iniettato. Posizionare gli animali torna sul ghiaccio se riflessi dolore sono evidenti. La procedura di iniezione ed elettroporazione prendono meno di 2-3 minuti in totale così tempo l'ipotermia, iniezione, e procedure elettroporazione conseguenza per mantenere l'anestesia appropriata.
2. Durante l'anestesia, con una pipetta standard con attenzione pipetta desiderata quantità di Plasmid miscela da iniettare (0,5-2 microlitri) su un pezzo di pellicola paraffina per riferimento. Qui, un volume totale di 0,5 ml di miscela plasmide viene iniettato. Successivamente, utilizzando un micro iniettore, inserire con attenzione montato pipetta capillare di vetro nella provetta contenente la miscela plasmide. Prendere ulteriore precauzione per evitare che la punta si rompa facendo in modo che non tocchi i bordi del tubo. Aspirare la soluzione nella pipetta lentamente componendo indietro la manopola di trasferimento. Una volta che un volume sufficiente è stato caricato nella pipetta, comporre avanti finché la pressione ritorna nella posizione neutra di 0 hPa.
3. Utilizzando 300-450 hPa Pressione per iniezione per assicurare pressione appropriata anche per il riempimento della piale superficie / spazio meningea, posizionare la punta vicina la pipetta di iniezione di paraffina riferimento pellicola di cera (da 2,2) e utilizzare il pedale dal micro iniettore per espellere uno Volume sulla pellicola paraffina. Regolare la pressione di conseguenza fino a quando l'importo espulso pari alla referenc precedenza pipettatie volume.
4. Una volta che la punta è stato equilibrato e anestesia è stata confermata, cuccioli sono pronti per essere iniettato.
5. L'obiettivo di questo esperimento è quello di iniettare la miscela plasmide sotto il cranio e sopra la superficie piale per consentire elettroporazione DNA verso il basso nella progenitori superficie piale (Figura 1A). Per le iniezioni di corteccia, tenere il cucciolo verso il basso con il pollice e l'indice della mano meno dominante. Gli emisferi corticali e di altre strutture superficiali come i colliculi superiori sono visibili tra P0 e P2, consentendo facile il targeting di queste strutture (Figura 1B). Usando la mano e porta la regione dominante desiderato di corteccia (es. motore, somatosensoriali, ecc), inserire pipetta oltre la pelle e il cranio avendo cura di evitare le arterie cerebrali. Assicurarsi evitare un'ulteriore penetrazione della punta passato cranio (che è indicato dall'assenza di ulteriore resistenza solo dopo aver forato il cranio).
6. Iniettare plasmasoluzione id usando il pedale del micro iniettore e assicurarsi che disperde in modo uniforme in tutto il (Figura 2A) dei tessuti.
   Nota: È molto importante determinare empiricamente un approccio che massimizza consegna plasmide evitando ematoma dovuto alla pressione del fluido. Questo può essere fatto regolando la durata dell'iniezione, l'angolo, il volume, e il sito di destinazione preciso per evitare interruzioni vascolare.
7. Assicuratevi di provare e tenere la punta si secchi tra le iniezioni posizionando la punta di goccioline di prova da iniezioni effettuate in precedenza su carta cera o paraffina pellicola di plastica. Questo è necessario per evitare l'accumulo punta della soluzione di DNA evaporato e cristallizzata, che può provocare l'intasamento della punta e dei volumi di consegna incoerenti.

3. Elettroporazione

1. Impostare il Elettroporatore a 135-150 V per cinque impulsi, della durata di 50 msec, con 950 msec intervalli tra ogni impulso. Al fine di aumentare la conduttanza eevitare di bruciare la pelle, coprire 3 mm tweezertrodes platino con gel elettroporazione. Verificare la presenza di riflessi-toe pizzicotti e di coda, a questo punto per garantire l'anestesia. Se reattivo, disporli sul ghiaccio per diversi minuti per anestetizzare.
2. Per corteccia (e collicolo superiore) iniezioni, impiegare un elettrodo di 3 mm (Figura 2B) per migliorare la vitalità dei cuccioli (rispetto al 7 - elettrodi e 10 mm, che vengono utilizzati per zona ventricolare elettroporazione). Posizionare la sonda carica negativa dell'elettrodo sull'area iniettato e la sonda carica positiva intorno alla regione controlaterale sotto l'occhio tale che l'orientamento elettrodo è a 45-60 ° rispetto alla linea mediana (Figura 2C).
3. Utilizzare il pedale del elettroporatore per innescare corrente e tenere tweezertrodes sul posto per 3-5 impulsi, a seconda dell'età e del peso dei cuccioli, in modo efficace il targeting DNA in cellule di superficie piale sottostanti nella contabilizzazione delle curvaturedegli emisferi.
   Nota: Il polo negativo può essere spazzato sull'area iniettabile in fra impulsi e un elettrodo grande può essere impiegato per aumentare l'area elettroporate.
4. Subito dopo l'elettroporazione, pulire accuratamente fuori dal gel da cuccioli e metterli sotto una lampada di calore per circa 5 min.
5. Pups saranno acutamente perderanno il loro colore rosso-rosa naturale nei minuti dopo l'elettroporazione a causa di cianosi. Osservare i cuccioli per il recupero di colore naturale e l'avvio di movimento normale prima di tornare alle loro gabbie.
6. Garantire risocializzazione con la madre osservando se lei porta i cuccioli al nido e comincia a governare loro. Se lei diventa aggressivo, assicurarsi che i cuccioli non hanno residui di gel e incubare con alcune delle assestamento di trasferire l'odore dei cuccioli.

4. Modifiche per Targeting collicolo superiore

Targeting:

1. Inject collicolo superiore nello stesso modo come la corteccia ma nota che la regione bersaglio si trova appena posteriormente e lateralmente al lambda e all'incirca sulla linea mediana (Figure 3A e 3B). Con iniezioni di successo, la miscela plasmide riempie naturalmente i contorni del collicolo superiore. Una volta che le iniezioni sono state fatte con successo, gli animali sono pronti per l'elettroporazione.

Elettroporazione:

1. In modo molto simile, per iniezioni collicolo superiore, posizionare la sonda carica negativa dell'elettrodo sull'area iniettato e la sonda carica positiva intorno all'occhio, muso o mento, guidando DNA nelle regioni superficiali del collicolo superiore (Figura 3C) . In questo caso, l'orientamento elettrodo è a 25-40 ° rispetto alla linea mediana.

Risultati

Pial superficiali risultati elettroporazione nell'espressione di DNA plasmidico in cellule principalmente progenitori-o vicino alla superficie piale ^6. Più in particolare, l'orientamento degli elettrodi è fondamentale nel dettare la direzione di movimento plasmide e successiva espressione. Così, in configurazioni a doppio elettrodo, il plasmide è diretto in circa un vettore retta tra l'elettrodo negativo e positivo. Pertanto, se il polo negativo è posta sopra il sito di iniezione e il polo po...

Discussione

L'aspetto più critico per il successo elettroporazione di cellule progenitrici superficie piale sono: 1) il targeting di mix plasmide alla superficie piale; 2) evitare la generazione di ematomi nel sito di iniezione; e 3) evitando la mortalità associate con elettroporazione mesencefalo.

Opportunamente mira la superficie piale si ottiene punzonamento misurata e attenta del cranio per evitare la penetrazione della superficie piale. Improprio di targeting per la pelle sovrastante o sottos...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fire Polished Borosilicate Tubing	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Micropipette Puller	Sutter Instruments Company	P-30
Fast Green FCF	Sigma Aldrich, Inc.	F7528
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments Company
ECM 830 Generator	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0052
3-mm Platinum Tweezertrodes	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0487
SignaGel Electrode Gel	Cardinal Health	70315-025
Tris-EDTA Buffer, pH 8.0	Integrated DNA Technologies, Inc.	11-01-02-05
Infrared Heat Lamp	VWR	36547-009
Fine Scissors Sharp	Fine Science Tools	14060-09