Néonatale Pial électroporation de surface

Résumé

La surface piale est une zone de progéniteur unique dans le système nerveux central qui reçoit une attention croissante. Ici, nous détaillons une méthode de manipulation génétique rapide de cette zone souches en utilisant une méthode d'électroporation modifié. Cette procédure peut être utilisée pour les enquêtes cellulaires et moléculaires de lignées cellulaires et les voies de signalisation impliquées dans la différenciation cellulaire et d'élucider le sort et les propriétés des cellules filles.

Résumé

Au cours des dernières années, la surface pial a été identifié comme un créneau germinal de l'importance au cours embryonnaire, périnatale et adulte neuro-et gliogénèse, y compris après une blessure. Cependant, les méthodes d'interrogation génétiquement ces populations de cellules progénitrices et de suivre leurs lignées ont été limitées en raison d'un manque de spécificité ou de temps de production de virus. Ainsi, les progrès réalisés dans cette région a été relativement lente avec seulement une poignée d'enquêtes de ce lieu. L'électroporation a été utilisée pour plus d'une décennie à étudier neurones propriétés de cellules souches dans l'embryon, et plus récemment dans le cerveau postnatal. Nous décrivons ici une technique efficace, rapide et simple pour la manipulation génétique des progéniteurs de surface piales fondées sur une approche d'électroporation adapté. Pial surface électroporation permet d'étiquetage génétique facile et la manipulation de ces progéniteurs, qui représente une approche gain de temps et économique pour l'étude de ces cellules.

Introduction

Cellules souches et progénitrices neurales sont présentes tout au long du mammifère CNS ^{1, 2.} Leur nature et les propriétés dans les zones germinales embryonnaires et adultes entourant les régions ventriculaires du cerveau et de la moelle épinière ont été largement documentés dans la dernière décennie ^1-3. En grande partie, cela est dû au développement d'outils génétiques de plus en plus précises, telles que le système nerveux spécifique recombinaison Cre des allèles floxé ou lignée rétroviral traçage ^4. Toutefois, une région-l'ancêtre géniteur de surface pial zone-a récemment été décrite en détail ^5-7 et attend examen complet.

La surface piale du cerveau est définie comme l'interface entre la surface du cerveau et des méninges entourant ^8. Au cours du développement, neuro et, plus tard, radiaux gliales pieds finaux attachent à cette surface ^9,10. Certains des sapinsst neurones dans le cerveau humain et de nombreux mitoses neuronales sont observés dans cette région ^11. Plus tard, au cours de la neurogenèse embryonnaire, les interneurones corticaux sont connus pour traverser la région pial, en plus de leurs routes migratoires dans la zone intermédiaire et la zone sous-ventriculaire ^12-14. Pendant cette période, les cellules souches peuvent être cultivées à partir de cette zone et il semble être un site actif de la neuro-et gliogénèse ^5. Dans le cerveau adulte, il a été rapporté que les interneurones peuvent être nés à partir de progéniteurs de surface piales après la provocation hypoxique ^7. Toutefois, la contribution de cette région à son à genensis cours du développement embryonnaire et postnatal est restée obscure en partie en raison de la difficulté d'enquêter spécifiquement cette région ^6. Dans le colliculus supérieur et dans le cortex cérébral, les interneurones superficielles (couche I ou dans le cortex) peuvent moduler la sortie du circuit de populations de neurones excitateurs sous-jacentes et de contribuer ainsi significantly à la fonction de ces structures. En particulier, la couche 1 interneurones sont en position privilégiée pour réguler la décharge des neurones à travers les couches supérieures du cortex cérébral en raison de leur connectivité étendue aux couches superficielles et profondes de colonnes corticales ^15,16. D'une manière similaire, les interneurones horizontales reçoivent entrée excitatrice à partir de fibres corticales et de la rétine, projet sur ​​une zone relativement large et sont spéculé à la médiation inhibition de populations neuronales répondant aux stimuli visuels à distance ^17,18. En outre, leur morphologie est bien adapté à jouer un rôle potentiel dans l'activité d'onde motifs dans le système visuel en développement ^19. Fait intéressant, le développement des interneurones et la maturation se produit dans une large mesure après la naissance. En outre, ce processus de maturation a été trouvé à être réglementées par l'activité neuronale et est donc un substrat de la plasticité du développement avec des conséquences pour la vie sur la fonction de circuit ^20,21. Notamment, no promoteurs sont décrits qui peuvent cibler spécifiquement ces cellules transgénique. Progéniteurs de division peuvent être ciblées avec rétrovirus ⁷ mais la production de virus est longue et requiert des compétences pour obtenir les titres élevés nécessaires pour la transduction cellulaire.

L'électroporation a conduit à une renaissance de l'étude de développement neurologique, car elle permet l'interrogation génétique rapide et efficace des voies de signalisation dans progéniteurs neuronaux ^{4, 22, 23.} L'électroporation implique l'injection d'ADN de plasmide, suivie par l'envoi d'impulsions électriques à l'extérieur de la tête, à conduire de manière unidirectionnelle de l'ADN dans les progéniteurs proliférant entourant les ventricules ^{4, 22, 23.} L'électroporation semble exiger transit à travers les cellules de la phase M du cycle cellulaire pour l'expression de transgènes plasmidiques ^24. Plus précisément, il a été trouvé que seulsles cellules passant à travers l'intérieur de la phase M 8 h d'électroporation de plasmides vont exprimer des transgènes malgré une livraison efficace de toutes les cellules à l'intérieur de ~ 160 um de la paroi ventriculaire ^24. On suppose que cela est dû à la nécessité d'une rupture de l'enveloppe nucléaire en permettant un accès nucléaire des plasmides épisomiques, en tant que produits chimiques provoquant la perméabilisation nucléaire peuvent induire l'expression de plasmides dans des cellules post-mitotiques ^25. Oeuvre à l'origine dans l'embryon ^22, l'électroporation a été adapté pour une utilisation dans le cerveau post-natal beaucoup plus tard ^{26, 27.} Récemment, nous avons adapté électroporation pour une utilisation dans la manipulation génétique des progéniteurs de surface piales ^6. En outre, en utilisant cette approche, nous avons montré qu'il existe apparemment deux lignées distinctes de progéniteurs dans cette région et astrocytaire ^{interneuronale-6.} Ce protocole détaille un moyen simple, rapide et puissant pour cibler ces cellules pour l'interrogatoirele développement de mécanismes de réglage de ces cellules.

Protocole

Cette procédure est conforme aux exigences Cedars-Sinai IACUC. Les chercheurs doivent s'assurer de la conformité institutionnelle IACUC avant de procéder. Tous les outils et les réactifs doivent être stérilisés avant leur utilisation.

1. Préparation des outils, des solutions, et l'ADN Mélange

1. Insérez borosilicate poli tubes capillaires en verre de 100 mm d'incendie dans un extracteur micropipette. Régler le chauffage pour permettre traction pondérée norme pour former la pointe de la pipette d'environ 17,5 mm. Couper des conseils avec des ciseaux chirurgicaux pointus à une distance d'environ 8-9 mm depuis le début de la pointe pour créer une ouverture à peu près 100 um de diamètre.
2. Faire un stock de 1% p / v solution vert rapide par mélange d'eau sans nucléase filtré (en utilisant un filtre de seringue de 20 um) en vert à séchage rapide.
3. Isoler l'ADN purifié exempt d'endotoxine plasmide qui est très concentré (c.> 3 pg / pl), dilué dans du Tris-EDTA (TE) tampon. Ajouter des quantités désirées du plasmideau mélange dilué dans du tampon TE et ajouter un rapport 1:10 de la solution vert rapide à 1% (fabrication d'un 0,1% p / v de concentration finale du vert rapide). Utilisez une concentration finale de 0,5-2,0 pg / pl du plasmide pour l'expression de transgènes robuste.

2. Anesthésie des animaux, Pipette Chargement en cours, et Pial Surface plasmide injection

1. Induire une hypothermie anesthésie sur des souris postnatale 1-2 jours en les plaçant sur une boîte de Pétri qui est placé sur la glace pendant 5-8 min (temps dépend de l'âge de chiot / poids). Une fois l'hypothermie est confirmée par l'absence de mouvement de pincement pincer et / ou de la queue réflexe, les souris sont prêts à être injecté. Placez animaux de retour sur la glace si les réflexes de la douleur sont évidents. La procédure d'injection et l'électroporation prennent moins de 2-3 min au total si le temps le hypothermie, injection, et les procédures d'électroporation en conséquence pour maintenir l'anesthésie appropriée.
2. Pendant l'anesthésie, à l'aide d'une pipette standard, soigneusement pipette quantité souhaitée de plasmid mélanger à injecter (0,5-2 pi) sur un morceau de pellicule de cire de paraffine pour référence. Ici, un volume total de 0,5 pi de plasmide mélange est injecté. Ensuite, en utilisant un micro injecteur, insérer soigneusement assemblé pipette capillaire en verre dans le mélange de plasmide contenant des tubes. Prendre des précautions supplémentaires pour éviter la pointe de la rupture en faisant en sorte qu'il ne touche pas les bords du tube. Aspirer la solution dans la pipette en composant lentement la molette de transfert. Une fois un volume suffisant a été chargée dans la pipette, composer avant jusqu'à ce que la pression revient à la position neutre de 0 hPa.
3. Utilisation de 300-450 hPa Pression pour injection pour assurer une pression appropriée pour un remplissage de la surface / espace méningé pial, placer la pointe à proximité de l'injection de paraffine de référence de film pipetté (de 2,2) et utiliser la pédale de l'injecteur micro pour éjecter un le volume sur le film de cire de paraffine. Régler la pression en conséquence jusqu'à ce que le montant est égal à la éjecté referenc auparavant pipettevolume de courrier.
4. Une fois la pointe a été équilibrée et l'anesthésie a été confirmée, les chiots sont prêts à être injecté.
5. Le but de l'expérience est d'injecter le mélange de plasmide sous le crâne et la surface piale ci-dessus pour permettre l'électroporation de l'ADN vers le bas dans les progéniteurs de surface pie-mère (Figure 1A). Pour les injections de cortex, tenir le chiot vers le bas avec le pouce et l'index de la main moins dominante. Les hémisphères corticaux et d'autres structures superficielles telles que les colliculi supérieures sont visibles entre P0 et P2, ce qui permet un ciblage facile de ces structures (Figure 1B). Utilisation de la région dominante de la main et la cible souhaitée du cortex (c.-moteur, somatosensoriel, etc), insérer pipette passé la peau et le crâne en prenant soin d'éviter les artères cérébrales. Assurez-vous de prévenir toute nouvelle pénétration de la pointe au-delà du crâne (qui est indiqué par l'absence de toute résistance juste après avoir percé le crâne).
6. Injecter plasmasolution id utilisant la pédale de l'injecteur micro et assurez-vous qu'il répartisse uniformément à travers le tissu (figure 2A).
   Remarque: Il est très important de déterminer de façon empirique une approche qui maximise la livraison de plasmide tout en évitant hématome dû à la pression du fluide. Cela peut être fait en ajustant la durée de l'injection, l'angle, le volume, et le site cible précise pour éviter la perturbation vasculaire.
7. Soyez sûr d'essayer de garder la pointe de sécher entre les injections en plaçant la pointe dans des gouttelettes d'essais d'injections faites précédemment sur un papier ciré ou un film de paraffine plastique. Cela est nécessaire pour éviter l'accumulation de pointe solution d'ADN évaporé et cristallisé, ce qui peut entraîner l'obstruction de la pointe et les volumes de livraison incompatibles.

3. Électroporation

1. Réglez le Electroporator à 135-150 V pour cinq impulsions, d'une durée de 50 ms, avec 950 ms intervalles entre chaque impulsion. Afin d'augmenter la conductance etéviter les brûlures de la peau, couvrir tweezertrodes de platine de 3 mm avec le gel de l'électroporation. Vérifiez réflexes de pieds-pincement et la queue à ce point pour assurer l'anesthésie. Si sensible, placer sur la glace pendant plusieurs minutes à anesthésier.
2. Pour cortex (colliculus supérieur) et des injections, employer une électrode de 3 mm (figure 2B) pour améliorer la viabilité des petits (par comparaison avec la 7 - et 10 mm des électrodes, qui sont utilisées pour la zone ventriculaire électroporation). Placer la sonde de charge négative de l'électrode au-dessus de la zone d'injection et la sonde chargée positivement autour de la région de l'oeil contralatéral au-dessous de telle sorte que l'orientation de l'électrode se trouve à un angle de 45 à 60 ° par rapport à la ligne médiane (Figure 2C).
3. Utilisez la pédale de l'électroporation pour déclencher courant et tenir tweezertrodes en place pour 3-5 impulsions, en fonction de l'âge de chiot et le poids, en ciblant efficacement l'ADN dans les cellules de surface piales sous-jacents lors de la comptabilisation de la courburedes hémisphères.
   Remarque: le pôle négatif peut être balayé au-dessus de la zone d'injection entre les deux impulsions ou une électrode plus grande peut être utilisée pour augmenter la surface électroporation.
4. Immédiatement après l'électroporation, soigneusement nettoyer gel de chiots et de les placer sous une lampe chauffante pendant environ 5 min.
5. Chiots aiguë perdre leur teinte rougeâtre-rose naturel dans les minutes après l'électroporation en raison de cyanose. Respecter les chiots pour la récupération de couleur naturelle et le début de l'action normale avant de les renvoyer dans leurs cages.
6. Assurer la resocialisation avec la mère en observant si elle apporte des petits au nid et commence à les toiletter. Si elle devient agressif, assurez-vous que les petits n'ont pas les restes de gel et de les incuber avec un peu de litière pour transférer l'odeur des petits.

4. Modifications pour le ciblage colliculi supérieure

Ciblage:

1. Inject le colliculus supérieur de la même façon que le cortex mais il faut noter que la région cible se trouve juste en arrière et latérale de lambda et à peu près à la ligne médiane (figures 3A et 3B). Avec des injections de succès, le mélange de plasmide remplit naturellement les contours du colliculus supérieur. Une fois les injections ont été faites avec succès, les animaux sont prêts pour l'électroporation.

Électroporation:

1. D'une façon très similaire, pour des injections de colliculus supérieur, placer la sonde chargée négativement de l'électrode sur la zone injectée et la sonde chargée positivement autour de l'oeil, museau ou le menton, la conduite de l'ADN dans les régions superficielles du colliculus supérieur (figure 3C) . Dans ce cas, l'orientation de l'électrode se trouve à un angle de 25 à 40 ° par rapport à la ligne médiane.

Résultats

Piales surface résultats d'électroporation dans l'expression de l'ADN plasmidique dans des cellules de la plupart des progéniteurs-à ou près de la surface pial ^6. Plus précisément, l'orientation des électrodes est critique en dictant la direction de déplacement du plasmide et l'expression subséquente. Ainsi, dans les deux configurations d'électrodes, le plasmide est dirigée à peu près dans un vecteur linéaire entre l'électrode négative et positive. Par conséquent,...

Discussion

L'aspect le plus critique pour l'électroporation réussie des progéniteurs de surface piales sont: 1) le ciblage du plasmide mélange à la surface pial; 2) en évitant la génération d'hématomes au site d'injection; et 3) en évitant la mortalité associées à l'électroporation mésencéphale.

Cibler de manière appropriée la surface pial est réalisé par perforation mesurée et soignée du crâne pour éviter la pénétration de la surface pial. Incorrecte de ci...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fire Polished Borosilicate Tubing	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Micropipette Puller	Sutter Instruments Company	P-30
Fast Green FCF	Sigma Aldrich, Inc.	F7528
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments Company
ECM 830 Generator	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0052
3-mm Platinum Tweezertrodes	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0487
SignaGel Electrode Gel	Cardinal Health	70315-025
Tris-EDTA Buffer, pH 8.0	Integrated DNA Technologies, Inc.	11-01-02-05
Infrared Heat Lamp	VWR	36547-009
Fine Scissors Sharp	Fine Science Tools	14060-09