Electroporation שטח pial ילודים

Summary

שטח pial הוא אזור אב ייחודי במערכת העצבים המרכזית, כי הוא מקבל תשומת לב גוברת. בזאת, אנו פירוט שיטה למניפולציה גנטית מהירה של אזור זה באמצעות אב שיטת electroporation שונה. הליך זה יכול לשמש לחקירות תאיות ומולקולרית של שושלות תאים ומסלולי איתות המעורבים בהתמיינות תאים ועל מנת להבהיר את גורלו ואת המאפיינים של תאי בת.

Abstract

בשנים האחרונות שטח pial זוהה כנישה נבטי חשיבות בנוירו וgliogenesis עובריים, לידה ומבוגר, ביניהם לאחר פציעה. עם זאת, שיטות לחקירה גנטית אוכלוסיות אב אלה ומעקב אחר השושלות שלהם היו מוגבלות בשל חוסר ספציפי או זמן רב ייצור של וירוסים. לכן, התקדמות באזור זה הייתה איטי יחסית עם רק קומץ של חקירות של מיקום זה. Electroporation שמש במשך יותר מעשור כדי ללמוד מאפיינים של תאי גזע עצביים בעובר, ולאחרונה גם במוח לאחר הלידה. כאן אנו מתארים טכניקה יעילה, מהירה, ופשוט למניפולציה הגנטית של אבות שטח pial מבוססים על גישת electroporation מותאמת. electroporation שטח pial מאפשר תיוג קליל גנטי ומניפולציה של אבות אלה, ובכך מייצג גישת חיסכון בזמן וחסכוני לחקר תאים אלה.

Introduction

תאי גזע עצביים ומצויים כעת בכל ¹ במערכת העצבים המרכזית של ^{היונקים, 2.} הטבע והנכסים באזורים נבטי עובריים ובוגרים המקיפים את אזורי חדרית של המוח וחוט השדרה שלהם תועדו בהרחבה בעשור האחרון ^1-3. במידה רבה, זה כבר בשל פיתוח כלים גנטיים מדויקים יותר ויותר, כגון רקומבינציה Cre הספציפית במערכת עצבים של אללים floxed או שושלת רטרווירלי התחקות ^4. עם זאת,-אזור הבדיקה המקיפה-יש אזור מוליד שטח pial לאחרונה תואר רק בכל פרט ^5-7 ומחכה אב אחד.

שטח pial של המוח מוגדר כממשק בין פני השטח של המוח וקרומי המוח שמסביב ^8. במהלך פיתוח, neuroepithelial, ומאוחר יותר, רגליים סוף גלייה רדיאלי לצרף שטח זה ^9,10. חלק מהאשוחנוירונים st במוח האנושי ורבים mitoses עצבי הם נצפו באזור זה ^11. מאוחר יותר, במהלך נוירוגנזה עוברית, interneurons קליפת המוח ידוע לחצות את אזור pial, בנוסף למסלולי הנדידה שלהם באזור ביניים והאזור subventricular ^12-14. במהלך תקופה זו, יכול להיות מתורבת בתאי גזע מאזור זה וזה נראה אתר פעיל של נוירו וgliogenesis ^5. במוח הבוגר, זה כבר דיווח כי יכול להיוולד interneurons מאבות שטח pial הבא אתגר חוסר חמצן ^7. עם זאת, תרומתו של אזור זה לו לgenensis במהלך התפתחות עוברית ואחרי הלידה נשארה מעורפלת בין שאר בשל הקושי באופן ספציפי חוקר אזור זה ^6. בcolliculus מעולה ובקליפת המוח, interneurons השטחי (או ששכבה בקליפת המוח) יכול לווסת את פלט המעגל של אוכלוסיות נוירון מעוררות בסיסית ובכך לתרום significantly לפונקציה של מבנים אלה. בפרט, interneurons 1 השכבה נמצא בעמדה מעולה כדי להסדיר את הירי של נוירונים בכל השכבות העליונות של קליפת המוח ניתנה הקישוריות הנרחבת שלהם לשכבות השטחיות ועמוקות של עמודות בקליפת המוח ^15,16. באופן דומה, interneurons האופקי מקבל קלט מעורר מסיבי קליפת המוח ורשתית, פרויקט על פני שטח רחב יחסית, והם העריכו לתווך עיכוב של אוכלוסיות עצביות מגיבות לגירויים חזותיים מרחוק ^17,18. כמו כן, המורפולוגיה שלהם היא מתאימה היטב לתפקיד פוטנציאלי בפעילות הגלים בדוגמת במערכת הראייה מתפתחת ^19. מעניין לציין, כי פיתוח interneuron והתבגרות קורה במידה רבה אחרי לידה. יתר על כן, כבר נמצא בתהליך התבגרות זה להיות מוסדר על ידי פעילות עצבית ולכן מצע של פלסטיות התפתחותית עם השלכות לכל החיים על תפקוד מעגל ^20,21. יש לציין, nהיזמים o מתוארים בו באופן ספציפי יכולה למקד תאים אלה transgenically. יכולים להיות ממוקדים אבות החלוקה עם רטרווירוס ⁷ אבל ייצור וירוס הוא זמן רב ודורש מיומנות להניב כותרות גבוהות הנדרשות לתמרת תא.

Electroporation הוביל לתחייה בחקר התפתחות הנוירולוגית שכן היא מאפשרת לחקירה גנטית מהירה ויעילה של מסלולי איתות באבות עצביים ^{4, 22, 23.} Electroporation כולל הזרקה של ה-DNA פלסמיד, ואחריו את המסירה של פולסים חשמליים לחלק החיצוני של הראש, לנהוג unidirectionally דנ"א לתוך תאי האב מתרבים המקיפים את חדרי הלב ^{4, 22, 23.} Electroporation מופיע לדרוש מעבר של תאים דרך שלב M של מחזור התא לביטוי של transgenes פלסמיד ^24. באופן ספציפי, זה כבר נמצא כי רקתאים עוברים שלב M בתוך 8 שעות של electroporation של פלסמידים יביעו transgenes למרות המשלוח שלהם היעיל לכל התאים בתוך ~ 160 מיקרומטר של קיר חדרי ^24. ישן סברה שזה נובע מצורך בפירוק מעטפת גרעין במאפשר גישה גרעינית של פלסמידים episomal, כמו כימיקלים שגורמים permeabilization הגרעיני יכולים לגרום לביטוי של פלסמידים בתאי הודעה המיטוטי ^25. מועסק במקור בעובר ^22, electroporation הותאם לשימוש במוח לאחר הלידה הרבה יותר מאוחר ^{26, 27.} לאחרונה, יש לנו להתאים electroporation לשימוש במניפולציה הגנטית של אבות שטח pial ^6. יתר על כן, שימוש בגישה זו שהראינו שיש כנראה שתי שושלות שונות של אבות באזור ^{6-איטרניורונאליים} וastrocytic זה. פרוטוקול זה מפרט את דרך פשוטה, מהירה, וחזקה כדי למקד את התאים האלה לחקירהשל פיתוח ויסות מנגנונים של תאים אלה.

Protocol

הליך זה בהתאם לדרישות Cedars-Sinai IACUC. חוקרים צריכים להבטיח עמידת IACUC מוסדית לפני שתמשיך. כל הכלים והחומרים הכימיים צריכים להיות מעוקרים לפני השימוש.

1. הכנת כלים, פתרונות, ותערובת ה-DNA

1. הכנס צינורות זכוכית נימי ורוסיליקט המלוטש אש 100 מ"מ לחולץ micropipette. הגדר חימום כדי לאפשר משיכה משוקללת סטנדרטית כדי ליצור קצה פיפטה של ​​כ 17.5 מ"מ. חותכים טיפים במספריים כירורגית חדים במרחק כ 8-9 מ"מ מההתחלה של הקצה כדי ליצור בערך פתיחת מיקרומטר קוטר 100.
2. הפוך מניית 1% w / v פתרון ירוק ומהיר על ידי ערבוב מים מסוננים nuclease חינם (ניצול מסנן מזרק 20-מיקרומטר) עם ירוק מהיר יבש.
3. לבודד את ה-DNA מטוהר ללא רעלן פנימי פלסמיד שמרוכז מאוד (כלומר> 3 מיקרוגרם / μl), בדילול מלא חיץ טריס-EDTA (TE). כמויות להוסיף רצויים של פלסמידלתערובת מדוללת בTE חיץ ולהוסיף יחס 01:10 של הפתרון הירוק מהר 1% (מה שהופך את 0.1% w / v ריכוז סופי של ירוק מהיר). השתמש בריכוז סופי 0.5-2.0 מיקרוגרם / μl של פלסמיד לביטוי חזק של transgenes.

2. בעלי החיים הרדמה, טוען פיפטה, והזרקת פלסמיד שטח pial

1. לגרום הרדמה היפותרמיה על עכברים לאחר הלידה 1-2 יום על ידי הצבת אותם בצלחת פטרי, כי הוא ממוקם על קרח למשך 5-8 דקות (זמן תלוי בגיל גור / משקל). ברגע שהיפותרמיה היא אושר על ידי חוסר התנועה מרפלקס זנב ו / או צביטת הבוהן, עכברים מוכנים להיות מוזרק. הנח חיות בחזרה על קרח אם רפלקסים כאב ניכרים. הליך ההזרקה וelectroporation לקחת פחות מ 2-3 דקות בסך הכל כל כך זמן היפותרמיה, ההזרקה, ונהלי electroporation בהתאם כדי לשמור על ההרדמה מתאימה.
2. במהלך הרדמה, באמצעות פיפטה סטנדרטית, בזהירות פיפטה רצויה כמות plasmiד לערבב להיות מוזרקים (0.5-2 μl) על גבי חתיכת סרט שעוות פרפין להתייחסות. כאן, בהיקף כולל של 0.5 μl של תערובת פלסמיד מוזרק. בשלב הבא, באמצעות מזרק מיקרו, להוסיף בזהירות פיפטה נימי זכוכית התאסף לתוך תערובת פלסמיד צינור המכיל. לנקוט אמצעי זהירות נוספת כדי למנוע את הקצה מהשבירה על ידי ביצוע בטוח שזה לא נוגע בקצוות של הצינור. לשאוב את הפתרון לתוך פיפטה על ידי החיוג באיטיות חזרה חיוג ההעברה. ברגע שנפח מספיק כבר נטען לתוך פיפטה, חייג קדימה עד החזרי לחץ למצב הניטרלי של 0 hPa.
3. שימוש 300-450 לחץ hPa להזרקה כדי להבטיח לחץ מתאים לאף מילוי של פני השטח / חלל קרום מוח pial, מקום הקצה סמוך הזרקת pipetted התייחסות סרט שעוות פרפין (מ2.2) ולהשתמש בדוושת הרגל מהזרקת מיקרו כדי להוציא אחד נפח על סרט שעוות פרפין. התאם את לחץ בהתאם עד הסכום נפלט שווה referenc pipetted בעברדואר בנפח.
4. ברגע שהקצה כבר equilibrated והרדמה כבר אישרה, גורים הם מוכנים להיות מוזרקים.
5. מטרת הניסוי היא להזריק את תערובת פלסמיד תחת הגולגולת ומעל פני השטח pial כדי לאפשר electroporation DNA כלפי מטה לתוך אבות pial פני השטח (איור 1 א). עבור זריקות קליפה, החזק את הגור מטה בעזרת האגודל ואצבע המורה של היד הדומיננטית פחות. ההמיספרות בקליפת המוח ומבנים שטחיים אחרים כגון colliculi מעולה גלויות בין P0 ו P2, המאפשרות מיקוד קליל של מבנים אלה (איור 1). שימוש באזור היד הדומיננטי והמטרה הרצויה של קליפת המוח (כלומר, מוטורי, החושית, וכו '), הכנס פיפטה עבר את העור והגולגולת לטפל כדי למנוע עורקי מוח. ודא כדי למנוע כל חדירה נוספת של הקצה האחרון הגולגולת (אשר מסומן על ידי חוסר התנגדות נוספת רק לאחר שרצעתי את הגולגולת).
6. הזרק plasmפתרון id באמצעות דוושת הרגל של הזרקת מיקרו ולוודא שהוא מפזר באופן שווה על פני (איור 2 א) לרקמות.
   הערה: חשוב מאוד כדי לקבוע את הגישה למיקסום משלוח פלסמיד, תוך הימנעות שטף דם בשל לחץ נוזלים באופן אמפירי. ניתן לעשות זאת על ידי התאמת משך ההזרקה, את הזווית, את עוצמת הקול, ואתר היעד המדויק על מנת למנוע פגיעה בכלי הדם.
7. הקפד לנסות ולשמור על הקצה מהתייבשות בין זריקות על ידי הצבת הקצה בטיפי בדיקה מזריקות שנעשו בעבר על נייר שעווה או פרפין סרט פלסטיק. זה נדרש כדי למנוע הצטברות קצה של פתרון ה-DNA התאדה והתגבש, אשר עלול לגרום לסתימה של הקצה וכרכי משלוח עולים בקנה אחד.

3. Electroporation

1. הגדר את electroporator ל135-150 V במשך חמש פעימות, שנמשך 50 אלפית שני, עם 950 מרווחים אלפיות שניים בין כל דופק. על מנת להגדיל את המוליכות ולמנוע שריפה של העור, לכסות tweezertrodes פלטינה 3 מ"מ עם ג'ל electroporation. הגעה לרפלקסים צובט בוהן וזנב בשלב זה, כדי להבטיח הרדמה. אם מגיב, מניח על קרח במשך כמה דקות כדי להרדים.
2. עבור זריקות קליפת המוח (וcolliculus מעולה), להעסיק אלקטרודה 3 מ"מ (איור 2) כדי להגדיל את הכדאיות של גורים (לעומת 7 - ואלקטרודות 10 מ"מ, המשמשים לelectroporation אזור חדרית). מניחים את חללית מטען השלילית של האלקטרודה מעל האזור המוזרק ובדיקת מטען החשמלית החיובי ברחבי האזור הנגדי מתחת לעין, כך שהנטייה היא באלקטרודה 45-60 ° זווית יחסית לקו האמצע (איור 2 ג).
3. השתמש בדוושת הרגל של electroporator כדי לעורר נוכחית ולהחזיק tweezertrodes במקום 3-5 קטניות, תלוי בגיל גור ובמשקל, ביעילות מיקוד DNA לתאי שטח pial בסיסי כאשר חשבונאי העקמומיותשל ההמיספרות.
   הערה: הקוטב השלילי ניתן שטף את אזור ההזרקה בבין הפולסים או האלקטרודה גדול יותר יכול להיות מועסק על מנת להגדיל את שטח electroporated.
4. מייד לאחר electroporation, לנקות בזהירות את הג'ל מגורים ולמקם אותם תחת מנורת חום למשך כ 5 דקות.
5. גורים בחריפות יאבדו את הגוון אדמדם ורוד הטבעי שלהם בדקות לאחר electroporation בשל כיחלון. שים לב הגורים להתאוששות של צבע טבעי והחניכה של תנועה נורמלית לפני החזרתם לכלובים שלהם.
6. ודא חיברות מחדש עם האם על ידי התבוננות אם היא מביאה את הגורים בחזרה לקן ומתחילה טיפוחם. אם היא הופכת להיות אגרסיבית, לעשות אין לי גורים בטוחים שאריות של ג'ל דגירה אותם עם חלק מהמצעים להעביר את הריח לגורים.

4. שינויים עבור מיקוד הקוליקולוס העליון

מיקוד:

1. Inject colliculus מעולה באותו אופן כקליפה אבל שים לב שאזור היעד נמצא ממש אחורי וצדדי למבדה ובערך בקו האמצע (3A ואיורים 3 ב). עם זריקות מוצלחות, תערובת פלסמיד באופן טבעי ממלאת את קווי המתאר של colliculus מעולה. ברגע שזריקות נעשו בהצלחה, בעלי החיים מוכנים לelectroporation.

Electroporation:

1. באופן דומה מאוד, לזריקות colliculus מעולים, למקם את חללית מטען השלילית של האלקטרודה מעל האזור המוזרק ובדיקת מטען החשמלית החיובי סביב העין, החוטם או הסנטר, נהיגה ה-DNA לתוך האזורים השטחיים של colliculus מעולה (איור 3 ג) . במקרה זה, את כיוון האלקטרודה הוא ב25-40 ° זווית יחסית לקו האמצע.

תוצאות

תוצאות pial משטח electroporation בביטוי של ה-DNA פלסמיד בתאים, בעיקר אבות, או בסמוך לפני שטח pial ^6. באופן ספציפי יותר, את הכיוון של אלקטרודות הוא קריטי במכתיב את כיוון התנועה וביטוי פלסמיד שלאחר מכן. כך, בתצורות אלקטרודה כפולה, פלסמיד מופנה בערך וקטור ישר בין האלקטרודה השלילי...

Discussion

ההיבט הקריטי ביותר עבור electroporation המוצלח של אבות שטח pial הוא: 1) מיקוד של תערובת פלסמיד אל פני השטח pial; 2) הימנעות מהדור של שטפי דם באזור ההזרקה; ו 3) הימנעות התמותה קשורה עם electroporation המוח התיכון.

כראוי מיקוד שטח pial מושגת על ידי ניקוב מדו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fire Polished Borosilicate Tubing	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Micropipette Puller	Sutter Instruments Company	P-30
Fast Green FCF	Sigma Aldrich, Inc.	F7528
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments Company
ECM 830 Generator	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0052
3-mm Platinum Tweezertrodes	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0487
SignaGel Electrode Gel	Cardinal Health	70315-025
Tris-EDTA Buffer, pH 8.0	Integrated DNA Technologies, Inc.	11-01-02-05
Infrared Heat Lamp	VWR	36547-009
Fine Scissors Sharp	Fine Science Tools	14060-09