신생아 Pial 표면 에레

요약

pial 표면은 증가 주목을 받고 CNS에서 독특한 전구 영역입니다. 여기서, 세부 사항보기 개질 전기 천공 법을 사용하여이 시조 존의 급격한 유전자 조작 방법을 우리. 이 절차는 세포 계통 및 세포 분화에 관련된 신호 전달 경로의 세포 및 분자 연구에 사용할 수 있습니다와 딸 세포의 운명과 특성을 설명하기 위하여.

초록

지난 몇 년 동안 pial 표면은 손상 후를 포함하여, 배아 산기 및 성인 신경과 gliogenesis 동안 중요성을 싹 틈새로 확인되었습니다. 그러나 유전이 전구 인구를 심문하고 그들의 계보를 추적하는 방법은 특이 또는 시간 바이러스의 생산을 소비의 부족으로 제한했다. 따라서,이 지역의 발전은이 지역의 연구 단지 소수의 상대적으로 느리다. 일렉트로은 배아의 신경 줄기 세포의 특성을 연구하기 년 넘게 사용하고, 최근에는 출생 후 뇌의되었습니다. 여기에 우리가 적응 일렉트로 방식에 따라 pial 표면 조상의 유전자 조작에 대한 효율적이고 신속하고 간단한 방법을 설명합니다. Pial 표면 일렉트로 따라서 이러한 세포 연구를위한 시간 절약과 경제적 인 접근 방식을 나타내는 이러한 조상의 손쉬운 유전자 표시 및 조작 할 수 있습니다.

서문

신경 줄기 및 전구 세포는 포유 동물 CNS ^{1, 2에} 걸쳐 존재한다. 자신의 성격과 뇌와 척수의 심실 지역 주변 배아와 성인 새싹 영역의 속성을 광범위하게 지난 십 ^1-3에 설명되어있다. 많은 부분에서, 이는 같은 floxed 대립 유전자 또는 ^4를 추적 레트로 바이러스 계통의 신경계 특정 크레 재결합으로 더욱 정확한 유전 도구의 개발에있다. 그러나 한 전구 지역 - pial 표면 전구 최근에 어떤 세부 ^5-7에 설명 된 영역 - 가지고 기다리고 종합 시험.

뇌 pial 표면은 뇌의 표면 및 주변 수막 ⁸ 간의 인터페이스로 정의된다. 나중에 개발, neuroepithelial하고, 동안, 반경 폐해 최종 피트는이 표면 ^{9, 10에} 연결합니다. 전나무의 일부인간의 두뇌와 신경 세포의 유사 분열의 많은 성 신경 세포는이 지역 ^11에서 관찰된다. 나중에 배아 신경 동안, 대뇌 피질의 interneurons는 중간 영역과 subventricular 영역 ^{12 ~ 14에서의} 이주 경로에 추가하여 pial 지역을 통과하는 것으로 알려져있다. 이 기간 동안, 줄기 세포는이 영역에서 배양 될 수 있고 신경 및 gliogenesis ^5의 활성 부위로 나타난다. 성인의 뇌에서,의 interneurons는 저산소 도전 ⁷ 다음 pial 표면 조상에서 태어난 될 수 있음을보고하고있다. 그러나, 배아 및 출생 후의 개발 기간 동안 genensis하는 자신에 대한이 지역의 기여로 인해 특히이 지역 ⁶ 조사의 어려움으로 일부 모호한 남아있다. 우수한 둔덕과 대뇌 피질에, 표면 (또는 피질 층 I)의 interneurons는 기본 흥분성 신경 세포 집단의 회로 출력을 조절하고, 따라서 signific를 기여할 수있다이러한 구조의 기능에 antly. 특히, 1 층의 interneurons는 대뇌 피질의 열 ^{(15, 16)의} 표면과 깊은 층에 자신의 광범위한 연결 주어진 대뇌 피질의 상위 계층에서 뉴런의 발화를 조절하는 주요 위치에 있습니다. 유사한 방식으로, 가로의 interneurons는 비교적 넓은 면적에 걸쳐 피질 및 망막 섬유 프로젝트에서 흥분성 입력을 수신하고 원격 시각적 자극 ^{(17, 18)에} 응답 신경원 인구의 억제를 중재하는 추측된다. 또한, 그들의 형태는 현상 카메라 시스템 ^(19)의 패터닝 표면파 활동 전위 역할을 매우 적합하다. 흥미롭게도, interneuron의 개발과 성숙은 출생 후 큰 정도 발생합니다. 또한,이 숙성 공정은 신경 활성에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다 따라서 회로 기능 ^{(20, 21)의} 평생 결과와 발달 가소성 기판이다. 특히, N오 발기인은 특히 transgenically이 세포를 표적으로 할 수있는 기술되어있다. 분할 전구 세포가 레트로 바이러스 ⁷ 대상이 될 수 있지만 바이러스의 생산 시간이 소요됩니다 세포 전달에 필요한 높은 역가를 산출하는 기술이 필요합니다.

이 신경 전구 세포 ^{4, 22, 23의} 신호 전달 경로의 신속하고 효율적인 유전자 심문을 허용으로 일렉트로는 신경 발달의 연구에서 르네상스를 주도하고있다. 전기 천공은 일방향 심실 ^{4, 22, 23를} 둘러싸고 증식 전구 세포로 DNA를 구동하는 헤드의 외부로의 전기 펄스의 전달 다음에 플라스미드 DNA의 주입하는 것을 포함한다. 일렉트로는 플라스미드 형질 전환 유전자 ^(24)의 식에 대한 세포주기의 M 단계를 통해 세포의 이동을 필요로 나타납니다. 구체적으로는 발견되었습니다 만이플라스미드의 일렉트로의 8 시간 이내 M 단계를 통과 세포는 심실 벽 ^(24)의 ~ 160 μm의 내의 모든 세포에 자신의 효과적인 전달에도 불구하고 도입 유전자를 표현하는 것입니다. 그것은 핵 permeabilization를 일으키는 화학 물질이 포스트 유사 분열 세포 ^(25)에 플라스미드의 발현을 유도 할 수있는이, 에피 솜 플라스미드의 핵 액세스를 허용 핵 봉투 고장의 필요성 때문이라고 추측된다. 원래 배아 ^22에 사용, 일렉트로는 훨씬 나중에 ^{26, 27} 출생 후의 뇌에 사용하기 위해 적응했다. 최근에, 우리는 pial 표면의 전구 세포 ^(6)의 유전자 조작에 사용하기 위해 전기 충격을 적응. 또한,이 방법을 사용하여 우리는 조상의 두 가지 계통이 지역 - interneuronal 및 성상 세포 ^6에 분명히 있다는 것을 보여 주었다. 이 프로토콜은 심문이 세포를 대상으로, 간단한 신속하고 강력한 방법의 자세한 사항이러한 세포의 조절 메커니즘 개발.

프로토콜

이 절차는 삼목 시나이 IACUC의 요구 사항에 따라입니다. 조사자는 이전 절차에 기관 IACUC 준수를 확인해야합니다. 모든 도구와 시약은 사용하기 전에 소독해야한다.

1. 도구의 제조, 솔루션 및 DNA 혼합물

1. 마이크로 피펫 풀러에 100-mm 화재 광택 붕규산 유리 모세관 튜브를 삽입합니다. 약 17.5 mm의 피펫 팁을 형성하는 표준 가중치를 풀 수 있도록 열을 설정합니다. 약 100 μm의 직경의 구멍을 만들 수있는 팁의 시작 부분까지의 거리 약 8~9밀리미터에서 날카로운 수술 가위로 끝을 잘라.
2. 주식에게 1 % w / 건조 빠른 그린으로 (20 μm의 주사기 필터를 사용) 필터링 핵산 분해 효소가없는 물을 혼합하여 빠른 그린 솔루션 V를 확인합니다.
3. 트리스-EDTA (TE) 버퍼에 희석 고도로 집중되어 정제 된 독소가없는 플라스미드 DNA (예> 3 ㎍ / μL)를 분리합니다. 플라스미드의 추가 원하는 양혼합물에 TE 버퍼에 희석 (w / 빠른 그린의 최종 농도 V 0.1 %를 만드는) 1 % 빠른 녹색 솔루션을 1:10의 비율을 추가합니다. 도입 유전자의 강력한 발현 플라스미드의 0.5 ~ 2.0 ㎍ / ㎕의 최종 농도를 사용합니다.

2. 동물 마취, 피펫 로딩 및 Pial 표면 플라스미드 주입

1. 5-8 분 (강아지 나이 / 무게에 따라 시간) 얼음에 배치 된 페트리 접시에 배치하여 1-2일 출생 후 마우스에서 저체온 마취를 유도한다. 저체온증이 발가락 곤란 및 / 또는 꼬리에서 반사 운동의 부족에 의해 확인되면, 마우스를 주입 할 준비가 된 것입니다. 통증 반사가 분명하면 얼음에 동물을 다시 넣습니다. 저체온증, 사출 및 일렉트로 절차를 따라 적절한 마취를 유지하는 시간, 그래서 주입 절차 및 일렉트로 합계보다 2 ~ 3 분을.
2. 마취하는 동안, 표준 피펫을 사용하여 조심스럽게 피펫 plasmi의 양을 원하는D 참조 파라핀 왁스 필름의 조각에 (0.5 μL)를 주입하는 혼합. 여기서, 플라스미드 믹스 0.5 μL의 총 부피가 주입된다. 다음, 마이크로 인젝터를 사용하여 조심스럽게 튜브 포함 플라스미드 혼합물로 조립 유리 모세관 피펫을 삽입합니다. 이 튜브의 가장자리에 닿지 않도록 확인하여 파손되는 팁을 방지하기 위해 추가 조치를 취. 천천히 이동 다이얼을 다시 전화를 걸어 피펫으로 솔루션을 대기음. 충분한 볼륨 피펫에로드되면, 0 고전력 증폭기의 중립 위치에 압력이 반환 될 때까지 앞으로 전화.
3. (2.2부터) 피펫 파라핀 왁스 필름 기준 주입 인근 팁을 배치, 심지어 pial 표면 / 수막 공간을 가득 채우는 적절한 압력을 확인하고 하나를 꺼내 마이크로 인젝터에서 풋 페달을 사용하여 주입을위한 300 ~ 450 고전력 증폭기의 압력을 사용하여 파라핀 왁스 필름에 볼륨. 배출 된 양이 이전에 피펫의 referenc에 달할 때까지 따라 압력을 조절전자 볼륨.
4. 팁 평형화되었고 마취 확인되면, 새끼 분사 될 준비가되었다.
5. 실험의 목표는 pial 표면 원종 (도 1a)로 아래쪽으로 DNA의 일렉트로 있도록 두개골 및 아래 pial 표면 위에 플라스미드 믹스를 주입하는 것이다. 피질 주사의 경우, 엄지 손가락과 덜 지배적 인 손의 검지 손가락을 사용하여 강아지를 누르십시오. 대뇌 피질 반구와 같은 뛰어난 colliculi 등의 표면 구조는 이러한 구조 (그림 1B)의 손쉬운 표적을 허용, P0과 P2 사이에 볼 수 있습니다. 피질의 지배적 인 손과 대상 원하는 영역 (등 즉, 모터, 체성 감각 등)를 사용하여, 대뇌 동맥에주의하면서 피부와 두개골을지나 피펫을 삽입합니다. (다만 두개골을 관통 한 후 더 저항의 부족에 의해 표시된다) 두개골을지나 끝의 더 침투를 방지해야합니다.
6. 혈장을 주입ID 솔루션은 마이크로 인젝터의 풋 페달을 사용하고 있는지 확인이 조직 (그림 2A)에 걸쳐 균등하게 분산합니다.
   참고 : 경험적으로 인해 유체 압력에 혈종을 피하면서 플라스미드의 전달을 극대화 방법을 결정하는 것이 매우 중요합니다. 이것은 분사 기간, 각도, 볼륨, 및 혈관 장애를 피하기 위해 정확한 목표 부위를 조정함으로써 행해질 수있다.
7. 시도하고 파라핀 종이 또는 플라스틱 파라핀 필름에 이전에 만든 주사에서 테스트 방울의 팁을 배치하여 주사 사이에 건조에서 팁을 유지해야합니다. 이것은 팁, ​​그리고 모순 대금 볼륨의 막힘을 초래할 수 증류 및 결정화 DNA 용액의 팁 축적을 방지하기 위해 필요하다.

3. 일렉트로

1. 각 펄스 사이에 950 밀리 초 간격으로, 50 밀리 초를 지속, 다섯 펄스에 135-150 V에 Electroporator을 설정합니다. 전도도를 증가시키기 위해 및피부의 연소를 방지, 일렉트로 젤 3 mm 백금 tweezertrodes 커버. 마취를 보장하기 위해이 시점에서 발가락 곤란 꼬리 반사를 확인합니다. 응답하는 경우, 마취 몇 분 동안 얼음에 배치합니다.
2. 외피 (뛰어난 둔덕) 주사를, (- 심실 영역에 전기 천공에 사용되는 10-mm 전극 (7)에 비해서) 송아지의 생존을 증가시키는 3 mm 전극 (도 2B)를 사용한다. 전극 방향이 중간 선 (그림 2C)에 45 ~ 60 °의 각도로되도록 눈 아래의 반대편 지역 주변의 주입 영역과 적극적으로 청구 프로브를 통해 전극의 부정 청구 프로브를 놓습니다.
3. 곡률에 대한 회계 할 때 전류를 트리거 할 electroporator의 풋 페달을 사용하여 효과적으로 기본 pial 표면의 세포에 DNA를 대상으로, 강아지의 나이와 체중에 따라 3-5 펄스 자리에 tweezertrodes 개최반구의.
   주 : 음극 펄스 또는 확대 전극 electroporation하여 면적을 증가하는데 사용될 수 사이에서 주입 영역을 석권 할 수있다.
4. 즉시 전기 충격 후, 조심스럽게 새끼에서 젤을 청소하고 약 5 분간 가열 램프 아래에 배치합니다.
5. 새끼 심하게 청색증에 의한 일렉트로 후 분에 자연 붉은 핑크 색상을 잃게됩니다. 자신의 새장에 반환하기 전에 자연적인 색깔 및 일반 운동의 개시의 복구를 위해 새끼를 관찰합니다.
6. 그녀가 다시 둥지에 새끼를 제공하고이를 정리 시작 여부를 관찰하여 어머니와 재 사회화를 확인합니다. 그녀는 공격적이되면 반드시 새끼 젤의 잔해를 가지고 새끼로 냄새를 전송하는 침구의 일부를 배양 실 수 있습니다.

4. 우수한 Colliculi를 대상으로하기위한 수정

대상 :

1. 인제CT 우수한 피질과 같은 방식으로 둔덕 만이 대상 지역이 단지 후부 및 람다 측면과 대략 중간 선에 자리 잡고 있습니다 (그림 3a 및 3b). 성공적인 주사로, 플라스미드 믹스 자연스럽게 뛰어난 둔덕의 컨투어를 채운다. 주사가 성공적으로되었습니다되면, 동물은 전기 충격에 대한 준비가되어 있습니다.

일렉트로 :

1. 매우 유사한 방식으로, 우수한 둔덕 주사를 위해, 우수한 둔덕의 표면 영역 (그림 3C)으로 DNA를 운전, 주입 영역과 눈, 코 또는 턱 주위에 적극적으로 청구 프로브를 통해 전극의 부정 청구 프로브를 배치 . 이 경우, 전극 방향은 정중선에 25 ~ 40 °의 각도로있다.

결과

세포 - 주로 조상 -이나 pial 표면 ⁶ 근처에있는 플라스미드 DNA의 발현에 Pial 표면 일렉트로 결과. 보다 구체적으로, 전극의 배향이 플라스미드 움직임과 후속 식의 방향을 지시하는 중요하다. 따라서, 이중 전극 구성에서, 플라스미드는 부정과 양극 사이에 거의 직선 벡터에 관한 것이다. 음극은 주사 부위 위에 배치되고 양극이 음극에 복부 롭다 따라서, 플라스미드 pial 표면으로 강제한다....

토론

pial 표면 조상의 성공적인 일렉트로의 가장 중요한 측면은 다음과 같습니다 : 1) pial 표면에 플라스미드 믹스의 대상; 2) 주사 부위 혈종의 발생을 회피; 및 3) 중뇌 전기 천공과 연관된 사망률을 회피.

적절하게 pial 표면을 대상으로하는 pial 표면의 침투를 방지하기 위해 두개골의 측정 및주의 천공에 의해 달성된다. 부드럽게 조직 (즉, 빠른 그린이 피부와 결합 조직의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fire Polished Borosilicate Tubing	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Micropipette Puller	Sutter Instruments Company	P-30
Fast Green FCF	Sigma Aldrich, Inc.	F7528
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments Company
ECM 830 Generator	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0052
3-mm Platinum Tweezertrodes	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0487
SignaGel Electrode Gel	Cardinal Health	70315-025
Tris-EDTA Buffer, pH 8.0	Integrated DNA Technologies, Inc.	11-01-02-05
Infrared Heat Lamp	VWR	36547-009
Fine Scissors Sharp	Fine Science Tools	14060-09