Neonatal Pial Superfície Eletroporação

Resumo

A superfície pial é uma zona de progenitor original no SNC, que está a receber cada vez mais atenção. Aqui, detalhamos um método para manipulação genética rápida desta zona progenitor usando um método de eletroporação modificado. Este procedimento pode ser usado para investigações celulares e moleculares de linhagens celulares e vias de sinalização envolvidas na diferenciação celular e para esclarecer o destino e as propriedades das células-filhas.

Resumo

Ao longo dos últimos anos, a superfície pial tem sido identificada como um nicho germinal da importância durante embrionário, perinatal e adulto neuro e gliogenesis, incluindo após lesão. No entanto, os métodos para interrogar geneticamente essas populações progenitoras e acompanhamento de suas linhagens foi limitada devido à falta de especificidade ou demorado produção de vírus. Assim, o progresso nesta região tem sido relativamente lento, com apenas um punhado de investigações sobre este local. Eletroporação tem sido usado por mais de uma década a estudar as propriedades de células-tronco neurais no embrião, e mais recentemente no cérebro pós-natal. Aqui nós descrevemos uma técnica eficiente, rápida e simples para a manipulação genética de células progenitoras de superfície pial com base em uma abordagem eletroporação adaptado. Pial eletroporação superfície permite a rotulagem genética fácil e manipulação desses progenitores, representando, assim, uma abordagem de economia de tempo e econômica para estudar essas células.

Introdução

Células-tronco e progenitoras neurais estão presentes em todo o SNC de mamíferos ^{1, 2.} A sua natureza e propriedades em zonas germinais embrionários e adultos que circundam as regiões do ventrículo do cérebro e da medula espinal tem sido extensivamente documentada na última década ^1-3. Em grande parte, isso se deve ao desenvolvimento de ferramentas genéticas cada vez mais precisos, como o sistema nervoso recombinação Cre específica de alelos floxed ou retroviral linhagem rastreamento ^4. No entanto, uma região-o progenitor exame abrangente pial progenitor superfície zona tem só recentemente foi descrito em detalhes ^5-7 e aguarda.

A superfície pial do cérebro é definida como a interface entre a superfície do cérebro e meninges circundantes ^8. Durante o desenvolvimento, neuroepithelial e, posteriormente, radiais metros finais da glia anexar a esta superfície ^9,10. Alguns dos abetost neurónios no cérebro humano e de muitos mitoses neuronais são observadas nesta região ^11. Mais tarde, durante a neurogénese embrionário, interneurónios corticais são conhecidos para atravessar a região pial, para além das suas rotas migratórias na zona intermédia e uma zona subventricular ^12-14. Durante este período, as células estaminais podem ser cultivadas a partir desta zona e que parece ser um sítio activo de neuro e gliogenesis ^5. No cérebro adulto, foi relatado que interneurónios pode ser carregado a partir de progenitores de superfície pial seguinte provocação hipóxica ^7. No entanto, a contribuição da região para sua a genensis durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal permaneceu obscura, em parte devido à dificuldade de investigar especificamente esta região ^6. No colículo superior, e no córtex cerebral, interneurónios superficiais (ou camada I no córtex) podem modular a saída do circuito de populações de neurónios excitatórios subjacentes e, portanto, contribuir significantly para a função destas estruturas. Em particular, uma camada de interneurônios estão em posição privilegiada para regular o disparo de neurônios ao longo das camadas superiores do córtex cerebral dada a sua ampla conectividade para as camadas superficiais e profundas das colunas corticais ^15,16. De maneira similar, interneurons horizontais receber entrada excitatória de fibras corticais e da retina, projeto sobre uma área relativamente grande e são especulado para mediar a inibição de populações neuronais que respondem a estímulos visuais remoto ^17,18. Além disso, a sua morfologia é bem adequada para desempenhar um papel potencial na actividade das ondas modelado no desenvolvimento do sistema visual ^19. Curiosamente, o desenvolvimento e maturação interneurônio acontece com um grande grau de pós-natal. Além disso, este processo de maturação foi encontrado para ser regulada por actividade neuronal e é, portanto, de um substrato de plasticidade de desenvolvimento ao longo da vida, com consequências sobre a função do circuito de ^20,21. Notavelmente, nO promotores são descritos que podem objetivar especificamente essas células transgenicamente. Progenitores em divisão pode ser alvo de retrovírus ^7, mas a produção do vírus é demorado e requer habilidade para produzir os títulos elevadas necessárias para a transdução de células.

Eletroporação levou a um renascimento no estudo do desenvolvimento neurológico, pois permite interrogatório genético rápido e eficiente de vias de sinalização das células precursoras neurais ^{4, 22, 23.} A electroporação envolve a injecção de DNA de plasmídeo, seguido pelo fornecimento de impulsos eléctricos para o exterior da cabeça, para conduzir unidireccionalmente do ADN nas células progenitoras que proliferam em torno dos ventrículos ^{4, 22, 23.} Electroporation parece requerer o trânsito de células através da fase M do ciclo celular para a expressão de transgenes de plasmídeo ^{de 24.} Especificamente, descobriu-se que somentecélulas que passam por fase M dentro de 8 horas de eletroporação de plasmídeos vai expressar transgenes apesar de sua entrega efetiva de todas as células dentro de ~ 160 mM da parede ventricular ^24. Especula-se que isto é devido à necessidade de repartição do envelope nuclear que permite o acesso nuclear dos plasmídeos epissomais, como produtos químicos que provocam a permeabilização nuclear pode induzir a expressão de plasmídeos nas células pós-mitóticas ^25. Originalmente utilizada no embrião ^22, electroporação foi adaptada para uso no cérebro pós-natal bem mais tarde ^{26, 27.} Recentemente, nós adaptamos electroporação para utilização na manipulação genética de células progenitoras de superfície pial ^6. Além disso, usando essa abordagem nós mostramos que há aparentemente duas linhagens distintas de células progenitoras na região-interneuronal e astrocitária ^6. Este protocolo detalha uma maneira simples, rápida e poderosa para direcionar essas células para o interrogatóriodo desenvolvimento de mecanismos de regulação destas células.

Protocolo

Este procedimento está em conformidade com os requisitos de Cedars-Sinai IACUC. Os investigadores devem garantir o cumprimento IACUC institucional antes de prosseguir. Todas as ferramentas e os reagentes devem ser esterilizados antes de utilizar.

1. Preparação de Ferramentas, Soluções e Mistura DNA

1. Insira 100 mm fogo borosilicato polido tubos capilares de vidro em um extrator micropipeta. Definir aquecimento para permitir a tração ponderada padrão para formar ponteira de aproximadamente 17,5 mm. Cortar pontas afiadas com tesouras cirúrgicas, a uma distância de aproximadamente 8-9 mm a partir do início da ponta para criar uma abertura de cerca de 100 um de diâmetro.
2. Faça um estoque de 1% w / v solução verde rápido pela mistura de água livre de nuclease filtradas (utilizando um filtro de seringa de 20 mm) com verde rápido seca.
3. Isolar o plasmídeo purificado de ADN livre de endotoxina que é altamente concentrada (ou seja,> 3 mg / mL), diluída em Tris-EDTA (TE) de tampão. Adicionar quantidades desejadas de plasmídeoa mistura diluída em tampão TE e adicionar uma proporção de 1:10 da solução verde rápido 1% (fazendo um 0,1% w / v de concentração final de verde rápido). Use uma concentração final de 0,5-2,0 mg / mL de plasmídeo para a expressão robusta de transgenes.

2. Animais Anestesia, Pipeta Carregando e Pial Superfície plasmídeo Injeção

1. Induzir a anestesia hipotermia em 1-2 dia ratos pós-natal, colocando-os em uma placa de Petri, que é colocado no gelo por 5-8 min (tempo dependente da idade filhote / peso). Uma vez que a hipotermia é confirmado pela falta de circulação de e / ou beliscar toe cauda reflexo, os ratos estão prontos para ser injetado. Coloque os animais de volta no gelo se reflexos da dor são evidentes. O procedimento de injeção e eletroporação levar menos de 2-3 minutos no total para que o tempo de hipotermia, injeção, e os procedimentos de eletroporação de acordo para manter a anestesia adequada.
2. Durante a anestesia, utilizando uma pipeta de padrão, cuidadosamente pipeta quantidade de plasmi desejard misturar a ser injetada (0,5-2 mL) sobre um pedaço de filme de cera de parafina para referência. Aqui, um volume total de 0,5 mL de mistura de plasmídeo é injectado. Em seguida, usando um injetor de micro, insira cuidadosamente montado pipeta capilar de vidro em tubo contendo mistura plasmídeo. Tenha cuidado extra para evitar a ponta de quebrar por ter certeza que ele não toque nas bordas do tubo. Aspirar a solução para a pipeta, discando-se lentamente para trás o botão de transferência. Uma vez que um volume suficiente foi carregado para a pipeta, disque para a frente até que a pressão retorna à posição neutra de 0 hPa.
3. Usando 300-450 hPa de pressão para injeção para assegurar a pressão adequada para um enchimento da superfície / espaço meníngea pial, coloque a ponta nas proximidades da injeção parafina referência filme pipetado (de 2,2) e usar o pedal do micro injetora para ejetar um de volume no filme cera de parafina. Ajuste a pressão de acordo até a quantidade ejetado é igual ao referenc previamente pipetadavolume de e.
4. Uma vez que a ponta tenha sido equilibrada e anestesia foi confirmado, os filhotes são pronta para ser injectada.
5. O objectivo da experiência é para injectar a mistura de plasmídeo sob o crânio e acima da superfície pial para permitir a electroporação do ADN para baixo, para os progenitores superfície pial (Figura 1A). Para injeções córtex, segurar o filhote para baixo, usando o polegar eo dedo indicador da mão menos dominante. Os hemisférios corticais e outras estruturas superficiais, tais como os colículos superiores são visíveis entre P0 e P2, permitindo a fácil orientação destas estruturas (Figura 1B). Usando mão e alvo a região dominante desejado do córtex (ou seja, motor, somatossensorial, etc), inserir pipeta passado a pele e crânio com cuidado para evitar artérias cerebrais. Certifique-se para impedir a continuação da penetração da ponta passado o crânio (o que é indicado pela ausência de uma maior resistência apenas após a perfuração do crânio).
6. Injetar plasmaID da solução usando o pedal do micro injetora e certifique-se dispersa uniformemente em todo o tecido (Figura 2A).
   Nota: É muito importante determinar empiricamente uma abordagem que maximiza a entrega plasmídeo evitando hematoma devido à pressão do fluido. Isto pode ser feito através do ajuste da duração da injecção, o ângulo, o volume, e o local alvo preciso para evitar ruptura vascular.
7. Não deixe de experimentar e manter a ponta de secagem entre as injeções, colocando a ponta em gotículas de teste a partir de injeções feitas anteriormente no papel de cera ou parafina filme plástico. Isto é necessário para evitar a acumulação de solução de ADN ponta evaporado e cristalizado, o que pode resultar no entupimento da ponta e volumes de entrega inconsistentes.

3. Eletroporação

1. Defina o Electroporator para 135-150 V para cinco pulsos, com duração de 50 milissegundos, com intervalos de 950 ms entre cada pulso. A fim de aumentar a condutância eevitar a queima da pele, cobre de 3 mm tweezertrodes platina com gel de electroporação. Verifique se há reflexos beliscar dedo do pé e cauda neste momento para garantir a anestesia. Se ágil, colocar no gelo por alguns minutos para anestesiar.
2. Para córtex (e colículo superior) injecções, empregar um eléctrodo de 3 mm (Figura 2B) para aumentar a viabilidade das crias (em comparação com a 7 - e 10-mm eléctrodos, os quais são utilizados para a zona ventricular electroporação). Coloque a sonda carregada negativamente do eléctrodo sobre a área injectado e a sonda carregada positivamente em torno da região abaixo do olho contralateral de modo que a orientação do eléctrodo é um ângulo de 45-60 ° em relação à linha média (Figura 2C).
3. Utilize o pedal da electroporador para acionar corrente e mantenha tweezertrodes no local por 3-5 pulsos, dependendo da idade das crias e de peso, de forma eficaz visando DNA em células da superfície pial subjacentes quando representando curvaturados hemisférios.
   Nota: O pólo negativo pode ser varrida sobre a área de injecção no meio de legumes ou um eléctrodo maior pode ser utilizada para aumentar a área de electroporação.
4. Imediatamente após a eletroporação, cuidadosamente limpar gel de filhotes e colocá-los sob uma lâmpada de calor por cerca de 5 min.
5. Filhotes vai agudamente perder sua tonalidade rosa-avermelhado natural nos minutos após eletroporação devido à cianose. Observe os filhotes para a recuperação da cor natural eo início do movimento normal antes de devolvê-los para suas gaiolas.
6. Certifique-se de re-socialização com a mãe, observando se ela traz os filhotes de volta ao ninho e começa a preparação deles. Se ela se torna agressivo, certifique-se filhotes de cachorro não tem restos de gel e incubar-los com algumas das roupas de cama para transferir o cheiro para os filhotes.

4. Modificações para Segmentação do colículos superiores

Segmentação:

1. Inject o colículo superior, da mesma maneira como o córtex, mas notar que a região alvo encontra-se imediatamente posterior e lateral de lambda e aproximadamente na linha média (Figuras 3A e 3B). Com injecções de sucesso, a mistura de plasmídeo naturalmente enche os contornos do colículo superior. Uma vez que as injecções foram feitas com sucesso, os animais estão prontos para electroporação.

Eletroporação:

1. De uma forma muito semelhante, para injecções colículo superior, colocar a sonda carregada negativamente do eléctrodo sobre a área injectado e a sonda de carga positiva em torno dos olhos, nariz ou queixo, ADN de condução para as regiões superficiais do colículo superior (Figura 3C) . Neste caso, a orientação do eléctrodo é um ângulo de 25-40 ° em relação à linha média.

Resultados

Pial superfície resultados electroporação na expressão do DNA de plasmídeo em células-principalmente progenitores-na ou perto da superfície pial ^6. Mais especificamente, a orientação dos eléctrodos é crítica em ditar a direcção de movimento do plasmídeo e expressão subsequente. Assim, em duas configurações de eléctrodos, o plasmídeo é dirigida em cerca de um vector de recta entre o eléctrodo negativo e positivo. Portanto, se o pólo negativo é colocado sobre o local da injecção e o p?...

Discussão

O aspecto mais crítico para electroporação bem sucedida de células progenitoras de superfície pial são: 1) a segmentação da mistura de plasmídeo para a superfície pial; 2) evitando a geração de hematoma no local da injecção; e 3) evitar a mortalidade associada com eletroporação mesencéfalo.

Apropriadamente segmentação da superfície pial é conseguido por meio de furos de medição e cuidado do crânio para evitar a penetração da superfície pial. Indevido de direcioname...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fire Polished Borosilicate Tubing	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Micropipette Puller	Sutter Instruments Company	P-30
Fast Green FCF	Sigma Aldrich, Inc.	F7528
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments Company
ECM 830 Generator	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0052
3-mm Platinum Tweezertrodes	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0487
SignaGel Electrode Gel	Cardinal Health	70315-025
Tris-EDTA Buffer, pH 8.0	Integrated DNA Technologies, Inc.	11-01-02-05
Infrared Heat Lamp	VWR	36547-009
Fine Scissors Sharp	Fine Science Tools	14060-09