异位黏膜移植程序直接给药到小鼠的大脑

摘要

已开发人力内镜颅底重建的小鼠模型，会使用鼻腔粘膜移植大脑和鼻子之间的半透界面。这种方法使研究人员能够研究发货到全身给药时，被排除在外，否则由血脑屏障高分子量治疗中枢神经系统。

摘要

递送治疗剂进入脑是通过血 - 脑屏障（BBB）的制约的极性和高分子量化合物从血液进入脑组织的通道的存在阻碍。一些直接交付的成功在人类已通过经颅导管植入已经实现;然而，这种方法具有很强的侵袭，并与众多的并发症。侵入性较低的替代办法是通过外科手术植入，半透膜如用于下列在人类鼻内镜切除肿瘤手术，以修复颅底缺损鼻黏膜剂量的大脑。药物传递虽然这种膜能有效地绕过血脑屏障，并直接扩散到脑和脑脊液。通过这种方法的启发，在小鼠的手术方法的开发，使用捐赠者间隔粘膜栽种了一个多颅外手术血脑屏障的缺陷。该模型已被证明能有效地允许的高分子量化合物的通路进入大脑。由于众多的候选药物都无法穿越血脑屏障，这种模式是对神经系统和精神疾病进行的新疗法临床前试验的价值。

引言

神经和精神疾病的治疗中是受到严重的血-脑屏障（BBB），防止所有潜在的药物制剂的95％以上到达中枢神经系统^1-3的存在阻碍。例如，神经胶质源性神经营养因子（GDNF）已被证明可有效地治疗帕金森氏病时，直接注射到大脑，交付时全身性，因为它不能穿透血脑屏障^4-6不过是无效的。

众多走近已经发展到试图绕过这个问题。改善全身递送neurotheraputics的已证实通过使用含有抗体的选择性为位于脑毛细血管内皮转运蛋白药物结合物;然而这种方法并没有被证明是适用于范围广泛的药物^7,8。此外，血脑屏障渗透性开放已经临床使用盟友，但这种方法从全身用药剂量患有而不是一个更直接的传递到感兴趣的⁹大脑区域。大量的努力已投入在优化直接针对大脑^10-12的希望鼻交付。虽然有些已经取得成功的，结论性的结果只获得针对药物具有内源性受体，如胰岛素^13,14。此外鼻交付机制一直存在争议证据通过嗅觉神经元摄取或通过血液¹¹暗示间接进入大脑。使用植入导管直接的，经颅传递已经实现，但这一程序具有很强的侵袭，并与众多的并发症^15,16关联。迄今为止，不存在一般的微创方法，以提供高分子量的化合物进入脑。

本文中所呈现的是一种鼠的外科手术创建与大脑半透界面。这是通过移植粘膜外植体¹⁷以上的小鼠外科开颅缺陷来实现的。使用此程序它已经表明，可溶性化合物高达500 kDa的可递送到中枢神经系统（直接进入脑实质以及进入脑脊液）在两个时间和分子量依赖性方式^18。绕过血脑屏障这种方法是一款型号为颅底缺损修复的人类，它使用血管黏膜瓣下鼻内镜手术^19,20修复颅骨孔。

研究方案

手术前一定要完成所有的程序是由IACUC和任何其他道德或法律部门批准，并使用人性化的动物治疗的做法。这包括使用无菌手术条件下，采用IACUC批准的方法麻醉小鼠，在手术过程中润滑老鼠的眼睛兽医药膏，并提供术后护理。不进行手术，如果有程序方面是否批准的任何问题。在此进行的所有程序批准了美国波士顿大学实验动物管理和使用委员会。

动物1。制备和手术用品

1. 高压灭菌的所有外科手术器械，将在手术过程中使用。
2. 确保所有要被执行的技术由动物监管机构的批准。

对黏膜移植2。收获

1. 之所以选择年龄相仿的基因相同的鼠标实验小鼠和安乐死它在IACUC批准的方法（这里：异氟醚窒息颈椎脱位）。
2. 用手术剪，去掉周围的鼻鼠标头部露出头骨区域的皮肤。
3. 用风钻，标记与三行其中的两个横向侧接鼻区域和三分之一在与垂直于连接两个线对眼睛线。
4. 以鼻中隔与周围组织分开向下钻取腹侧。较宽的路径将防止损坏粘膜然而它也将使其更难以分离的膜。窄馏分接近中线建议。
5. 用剪刀剪开隔膜免于粘附到它的任何组织，并将其存储在无菌含盐溶液。此时的接枝可以被清理以除去任何已连接的组织。理想的情况是有完好的粘膜暴露在软骨隔膜的两侧。一克船尾可以提供膜为两只小鼠中提供的隔膜的表面积是足以覆盖开颅手术位点。建议接枝用于尽可能快地和研究者进行到只要接枝分离步骤3。

黏膜移植的3。手术植入

1. 使用标准的无菌鼠外科手术，麻醉和挂载鼠标在体视框。用啮齿动物麻醉机在纯氧约2％异氟醚。
2. 固定鼠标在耳酒吧和鼻子座立体定位仪。适用眼药膏眼睛和擦洗头皮与优碘和75％乙醇三轮。无论是使用剪刀或剪的头发，去掉头上的皮毛。暴露颅骨用刀片及平头。进行开颅上面将要给药的脑的位置。例如，当针对纹状体切1.25毫米直径圆孔的颅骨（集中在美联社：1.00毫米; ML：0.88 MM）使用风钻。用无菌生理盐水湿润钻孔区域，使用刀片来去除颅骨。
3. 小心地用针的尖端去除硬脑膜。此外，这可以通过应用组织粘合剂的最小量的湿润硬脑膜表面来实现。一旦该层硬化后，用剃刀刀片尖端的横向运动可以用来除去该膜。
4. 将粘膜上述脑表面采取特别小心，以保持上皮面朝远离伤口。这最好通过将整个隔膜上以相邻的开颅手术现场用镊子颅骨的表面进行。使用一对外科手术剪刀的尖端，拉膜断软骨和到颅骨和脑表面。不要让膜变干，或与任何吸收材料去碰它。移植物应该慷慨地重叠开颅S的所有骨边缘伊特。
5. 覆盖移植物用无菌一块腈。这个作用是防止皮肤的密合性的接枝愈合过程。腈需要足够大以覆盖整个粘膜。如果需要修剪过度膜。避免腈的任何运动，一旦它接触到的接枝接触。
6. 收与正在运行的5-0无菌缝合皮肤和让鼠标在进行下一步骤之前恢复3-7天。小心不要扰乱皮肤缝合过程中腈障碍或黏膜移植。

给药溶液4。管理

1. 确保麻醉鼠标在立体框架后，切开缝合用剪刀除去周围的头骨多余的皮肤。
2. 除去腈屏障和清洁颅骨的表面上。用无菌生理盐水和棉签来清洁该部位，直到移植是可见的。它可能需要削减接枝用剃刀如果已经成长比d大esired表面积。
3. 如果实验将超过几天时间，这是明智的植入至少两个骷髅头螺丝，以加强头部植入物。
4. 将接枝上面的井，使得边缘与颅骨接触。应用氰基丙烯酸酯粘合剂在井和颅骨之间的交界处。填井用无菌生理盐水和检查，以确保没有泄漏。井从切口注射器针头制成。
5. 取适量涂抹于颅骨骨水泥来固定准备就绪。
6. 从井用吸管除去盐水。洗好几次，以确认粘合剂不被泄露。添加所需的解决方案;在这种情况下，加入50μl荧光葡聚糖的使用。预期类似的极性的水溶性化合物会表现一样葡聚糖。递送疏水性化合物或悬浮液尚未探索用这种方法。
7. 通过使用一块圆形腈固定在盖上井的顶部页首使用氰基丙烯酸酯胶粘剂。确保粘接不来与良好的内容接触。

5，分析粘膜递送的

1. 经过所需的时间量已经过去，麻醉小鼠，并用伊文思蓝染料的溶液交换以及内容。这种染料是用来验证该接枝是完整的。
2. 30分钟后，麻醉小鼠重，除去染料溶液，并且通过断头安乐死。
3. 手动移除植入物及手术用剪刀取出大脑。请小心将移植物到位。
4. 一旦去除，闪光冻结大脑中的异丁烷的溶液冷却在干冰浴中。
5. 嵌入在大脑最佳切削温度（OCT）解决方案和切片在50微米。
6. 直接将所需的切片在显微镜载玻片上。
7. 图片只要华侨城解决方案已经干涸使用荧光显微镜切片。

结果

获得足够大的鼻中隔外植体是用于随后的步骤是至关重​​要的。这可以通过在该位置上， 如图1a中所示的供体小鼠的颅骨钻孔来完成。沿着这条路径切割将产生足够大小的外植体， 如图1b所示 。如果钻孔深度不够深，移植将被截断，这将是很难获得足够大的膜覆盖大脑表面。多钻横向比建议的路径是不妥当的，因为更多的组织会留在鼻中​​隔，下一个步骤将是更加?...

讨论

本文所描述的过程中最困难的步骤是一个足够大的粘膜的成功转移到脑表面。这一步是由显著容易，如果收获的鼻中隔足够大，打扫好。如果隔膜的腹侧部分被截断，应获得一个新的移植物。钻孔角度应垂直于鼠标头，以确保粘膜不被钻头损坏。如果宽度大于推荐钻孔通道被接便更难除去，其连接到该隔膜的额外的组织。任何大块的结缔组织应该用锋利的剪刀割伤，而不是试图拉他们松被删除。?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	Taconic	C57BL/6
Isoflurane	Piramal Healthcare
Student fine scissors	Fine Science Tools	91461-11
Pneumatic drill	MTI Dental	333-CB
Drill bit
Forceps	Fine Science Tools	91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP	Abbott Laboratories	4925
Polystyrene Petri dish	Fisher	08-757-12	for temporarily storing graft
Bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Oxygen/Isoflurane System	SurgiVet	V720100
Temperature Control System	Physitemp	TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument	KOPF	Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators	Fisher	23-400-106
7.5% Providone iodine			Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless	Feather	2976#10
Scalpel handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
3% Hydogen peroxide			for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Needles	Becton, Dickinson and Company	305176	needle tip cut off and used as well
Syringes	Becton, Dickinson and Company	309597
Nitrile gloves	Denville Scientific Inc	G4162	for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder	Fine Science Tools	91201-13
Cyanoacrylate adhesive			commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque	Stoelting	51458
Isobutane (2-methylbutane)	Aldrich	M32631	for dry ice bath
Dry ice