쥐의 뇌에 직접 약물 전달 이소성 점막 Engrafting 절차

요약

인간의 내시경 두개골 바닥 재건의 마우스 모델은 코 점막 이식을 사용하여 뇌와 코 사이의 반투과성 인터페이스를 만듭니다 개발되었다. 이 방법은 연구자가 체계적으로 관리, 그렇지 않으면 혈액 - 뇌 장벽에 의해 제외되는 고 분자량 치료제의 중추 신경계에 전달을 연구 할 수 있습니다.

초록

뇌에 치료제의 전달은 혈액으로부터 뇌 조직으로 극성 및 고 분자량 화합물의 통과를 제한하는 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 존재에 의해 방해된다. 인간의 일부 직접 배달 성공은 두개의 카테터 주입을 통해 달성되었다; 그러나이 방법은 고도의 침략과 수많은 합병증과 관련이 있습니다. 보다 적게 침략적인 대안은 인간의 내시경 transnasal 종양 제거 수술 후 두개골 바닥 결함을 수리하는 데 사용되는 코 점막 등의 이식 수술, 반투막을 통해 뇌를 투약하는 것입니다. 하지만 약물 전달이 막 효과적으로 BBB를 무시하고 뇌와 중추 신경계에 직접으로 확산 될 것이다. 이 방법에 의해 영감을, 마우스의 수술 방법은 extracranial 수술 BBB 결함에 접목 기증자 중격 점막을 사용하는 개발되었다. 이 모델은 효과적으로 표시되었습니다뇌에 고 분자량 화합물의 통과를 허용한다. 많은 약물 후보가 BBB를 횡단하는 능력이 있기 때문에,이 모델은 신경 및 정신 질환에 대한 새로운 치료법의 전임상 시험을 수행 할 가치가있다.

서문

신경 및 정신 질환의 치료는 심각한 중추 신경계 ^{1-3에 도달하는} 모든 잠재적 약제의 95 % 이상을 방지 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)의 존재에 의해 방해된다. 예를 들어, 신경교는 신경 친 화성 인자 (GDNF)를 파생은 BBB ^4-6을 관통 할 수 없기 때문에 전신적 전달되는 경우에는 비효율적이다, 뇌에 직접 분사하면 파킨슨 병의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다.

수많은 접근이 문제를 회피하는 것을 시도하기 위해 개발되었다. neurotheraputics의 전신 배달의 개선은 뇌의 모세 혈관 내피 세포에있는 수송 단백질에 대한 선택적인 항체를 포함하는 약물 접합체를 사용하여 증명되었다; 그러나이 방법은 의약품 ^7,8의 광범위한 적용 할 수 표시되지 않았습니다. 또한, BBB의 삼투압 개방 병원에 사용 된또한 ^9의 뇌 영역에 대한보다 직접 배달에 반대 동맹, 그러나이 방법은 전신 약물 투여에서 겪고있다. 상당한 노력이 직접 뇌 ^10-12을 대상으로의 희망에 transnasal 전달을 최적화에 투입되었습니다. 약간의 성공이 달성되었지만, 결정적인 결과는 인슐린의 ^{13, 14} 등의 내생 적 수용체를 가지고 의약품에 대한 얻어졌다. 또한 transnasal 전달의 메커니즘은 후각 신경 세포의 흡수를 통해 또는 혈류 ^(11)를 통해 뇌에 간접적 인 항목을 제안 증거가 논란이되었습니다. 이식 카테터를 사용하여 직접, 두개 배달 그러나이 절차가 매우 침략과 수많은 합병증 ^{(15, 16)와} 연결되어, 달성되었습니다. 지금까지 뇌에 고분자 화합물을 제공하는 일반적인 침습적 방법이 없다.

쥐의 수술은 여기에 있습니다 발표즉, 뇌와 반투과성 인터페이스를 만듭니다. 이것은 마우스의 수술 적 개두술의 결함을 통해 점막 이식편 ¹⁷ engrafting하여 수행됩니다. 이 절차를 사용하여 500 kDa의 최대 가용성 화합물은 시간과 분자량 의존적 ⁽¹⁸⁾ 모두에서 중추 신경계 (직접 뇌 실질에뿐만 아니라 뇌척수액에)에 전달 될 ​​수있는 것으로 나타났습니다. BBB를 우회하는이 방법은 transnasal 내시경 수술 ^{19, 20} 다음의 두개골에 구멍을 복구하는 혈관 점막 이식을 사용하여 인간의 두개골 바닥의 결함 수리를위한 모델이다.

프로토콜

수술에 앞서 수행되는 모든 절차가 IACUC 및 추가 윤리적 또는 법적 당국의 승인을 인간 동물의 치료 방법을 사용하고 있는지 확인합니다. 이것은 불임 수술 조건을 사용하여 IACUC이 방법을 승인하여 마우스를 마취, 수술하는 동안 의사의 연고와 마우스의 눈을 윤활 및 수술 후 관리를 제공하는 단계를 포함한다. 절차의 측면이 승인 여부를 질문이있는 경우에 수술을 진행하지 마십시오. 여기에 수행 된 모든 절차는 보스턴 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 동물의 준비 및 외과 용품

1. 수술 중에 사용되는 모든 수술 악기를 압력솥.
2. 수행 할 수있는 모든 기술이 동물 규제 기관에 의해 승인되어 있는지 확인하십시오.

점막 이식의 2. 수확

1. 로 비슷한 나이의 유 전적으로 동일한 마우스를 선택했다실험 마우스 (여기 : 자궁 경부 전위 다음에 이소 플루 란 질식) IACUC 승인 된 방법에 안락사.
2. 외과 용 가위를 사용하여 두개골을 노출 마우스 머리의 코 지역 주위의 피부를 제거합니다.
3. 옆으로 코 지역과 수직으로 두 줄을 연결하는 눈 라인의 세 번째 측면에 두 세 가지의 라인 공압 드릴, 마크.
4. 주변 조직에서 비중격을 분리하기 위해 배쪽으로 드릴 다운. 넓은 경로, 그러나 그것은 또한 더 어렵게 멤브레인을 분리 할 것이다 점막의 손상을 방지 할 것이다. 가까운 중간 선에 좁은 컷을 권장합니다.
5. 여기에 부착 된 모든 조직에서 무료로 격막을 절단하고 멸균 식염수에 저장하기 위해 가위를 사용합니다. 이 때 수술이 연결된 조직을 제거하는 청소 할 수 있습니다. 이상적인 상황은 피해 점막 멤브레인 연골 격벽의 양​​측에 노출하는 것이다. 한 GR선미는 멤브레인의 표면적이 개두 사이트를 커버하기에 충분한 제공이 생쥐위한 멤브레인을 공급할 수있다. 그것은 이식이 가능한 한 빨리 사용하고 연구자가 즉시 이식이 격리로 3 단계로 진행하는 것이 좋습니다.

점막 이식 3. 외과 이식

1. 표준, 무균 쥐의 수술 절차를 사용하여, 마취 및 stereological 프레임에 마우스를 탑재합니다. 쥐의 마취 기계를 사용하여 순수한 산소에 약 2 % 이소 플루 란 (isoflurane)을 사용합니다.
2. 귀 바, 코 홀더 정위 장치에 마우스를 고정시킨다. 눈에 안과 연고를 적용하고 3 라운드에 대한 베타 딘 75 % 에탄올로 두피를 문질러. 가위 나 머리 트리머를 사용하여, 머리에 모피를 제거합니다. 면도날 두개골을 드러내고 헤드 수평. 투여 할 뇌의 위치 위의 개두술을 수행합니다. 예를 들어, 선조체를 타겟팅은 1.25 mm 컷공기 드릴을 사용 :; (0.88 mm ML 1.00 mm AP를 중심으로) 두개골 직경 원형 구멍. 멸균 식염수로 드릴 된 영역을 적시고 두개골을 제거하기 위해 면도날을 사용합니다.
3. 조심스럽게 바늘의 끝 부분을 사용하여 경질을 제거합니다. 또한,이 촉촉한 경막 표면 조직 접착제의 최소량을 적용함으로써 달성 될 수있다. 이 층은 경화되면 면도날 팁의 수평 방향 운동은 멤브레인을 제거하는데 사용될 수있다.
4. 멀리 상처에 직면 상피면을 유지하기 위해 극도의주의를 복용 뇌 표면 위의 점막을 놓습니다. 이것은 가장 핀셋 개두술 사이트에 인접한 두개골의 표면에 전체 격막을 전송하여 수행됩니다. 수술 가위의 끝 부분을 사용하여 연골의 할인 및 두개골과 뇌 표면에 막을 당겨. 막 건조 또는 흡수 물질과 접촉하지 마십시오. 이식 아낌없이 개두술의 S의 모든 뼈 가장자리를 오버랩한다ITE.
5. 니트릴의 살균 조각으로 이식을 커버. 이것은 치유 중에 그래프트에 피부의 부착을 방지하는 역할을한다. 니트릴은 전체 점막을 커버 할만큼 커야 할 필요가있다. 필요한 경우 과도한 막 트림. 그것은 이식과 접촉되면 니트릴의 움직임을 피하십시오.
6. 실행 5-0 멸균 봉합사로 피부를 닫고 마우스가 다음 단계로 진행하기 전에 3~7일에 복구 할 수 있습니다. 피부 폐쇄하는 동안 니트릴 장벽 또는 점막 이식을 교란하지 않도록주의하십시오.

분배 솔루션 4. 관리

1. 고정대에 마취 된 쥐를 확보 한 후, 가위로 봉합을 잘라 두개골 주위에 여분의 피부를 제거합니다.
2. 니트릴 장벽을 제거하고 두개골의 표면을 청소합니다. 이식이 보일 때까지 지역을 청소하는 멸균 식염수 면봉을 사용합니다. D보다 큰 성장하면 면도칼로 이식을 절단해야 할 수도 있습니다표면적 명령 1.
3. 실험이 몇 일 이상이 될 경우, 그것은 머리 이식을 강화하기 위해 적어도 두 개의 두개골 나사를 이식하는 것이 현명하다.
4. 가장자리가 두개골과 접촉되도록 이식 위의 잘 놓습니다. 잘와 두개골 사이의 교차점에 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용합니다. 멸균 식염수로 잘 입력하고 확인 누출이 없는지 확인하십시오. 웰스는 컷 주사기 바늘 만들어진다.
5. 장소에 잘을 확보하기 위해 두개골에 골 시멘트를 적용합니다.
6. 피펫으로 우물에서 염분을 제거합니다. 그 접착제가 원하는 솔루션을 추가 인치 유출되지 확인도 여러 번 세탁; 이 경우 형광 덱스 트란 50 μL가 사용됩니다. 이것은 유사한 극성의 수용성 화합물은 덱스 트란과 동일하게 동작 할 것으로 예상된다. 소수성 화합물 또는 현탁액의 배송이 방법으로 탐구되지 않았습니다.
7. 고정 니트릴 원형 조각을 사용하여 웰의 상부 캡시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용하여 맨. 접착제가 아니라 내용에 접촉하지 않도록하십시오.

점막 납품 5. 분석

1. 원하는 시간이 경과 한 후, 마우스를 마취하고 에반의 청색 염료의 용액으로 웰 내용물을 교환한다. 이 염료는 이식이 손상되었는지 확인하는 데 사용됩니다.
2. 30 분 후, 마우스를 심하게 마취 염료 용액을 제거하고, 잘린 통해 안락사.
3. 수동으로 임플란트를 제거하고 수술 가위를 사용하여 두뇌를 제거합니다. 장소에 이식 않도록주의하십시오.
4. 일단 제거되고, 플래시 동결 이소 부탄의 용액에 뇌는 드라이 아이스 욕에서 냉각시켰다.
5. 최적 절단 온도 50 ㎛에서 (10 월) 솔루션과 조각에 뇌를 포함합니다.
6. 현미경 슬라이드에 직접 원하는 조각을 놓습니다.
7. 이미지 즉시 OCT의 솔루션은 건조되면서 개화 현미경을 사용하여 조각.

결과

충분히 큰 비중격 이식편을 얻기 후속 단계에 대한 매우 중요합니다. 이것은도 1a에 도시 된 도너 마우스의 두개골에 위치에 드릴에 의해 달성 될 수있다. 그림 1b에서와 같이이 경로를 따라 절단 충분한 크기의 이식편을 생성합니다. 드릴링 깊이가 깊은 충분하지 않은 경우, 그래프트는 잘리고 그 뇌의 표면을 커버하도록 충분히 큰 막을 얻기 어려울 것이다. 이상의 조직 ...

토론

본원에 기술 된 과정에 가장 어려운 단계는 뇌 표면에 충분히 크기 점막의 성공적인 전송이다. 수확 비중격가 충분하고 잘 청소하는 경우이 단계는 훨씬 쉬워졌다. 격막의 복부 부분이 잘리는 경우, 새로운 이식을 얻을 수 있어야합니다. 드릴링 각도 점막이 드릴에 의해 손상되지 않도록 마우스 헤드에 수직이어야한다. 추천하는보다 넓은 드릴링 경로 촬영할 경우는 격막에 연결되어 여분의 조직...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	Taconic	C57BL/6
Isoflurane	Piramal Healthcare
Student fine scissors	Fine Science Tools	91461-11
Pneumatic drill	MTI Dental	333-CB
Drill bit
Forceps	Fine Science Tools	91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP	Abbott Laboratories	4925
Polystyrene Petri dish	Fisher	08-757-12	for temporarily storing graft
Bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Oxygen/Isoflurane System	SurgiVet	V720100
Temperature Control System	Physitemp	TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument	KOPF	Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators	Fisher	23-400-106
7.5% Providone iodine			Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless	Feather	2976#10
Scalpel handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
3% Hydogen peroxide			for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Needles	Becton, Dickinson and Company	305176	needle tip cut off and used as well
Syringes	Becton, Dickinson and Company	309597
Nitrile gloves	Denville Scientific Inc	G4162	for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder	Fine Science Tools	91201-13
Cyanoacrylate adhesive			commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque	Stoelting	51458
Isobutane (2-methylbutane)	Aldrich	M32631	for dry ice bath
Dry ice