Heterotopic muqueuse procédure de greffe de médicaments Livraison directe au cerveau chez les souris

Résumé

Un modèle de souris de la reconstruction de la base du crâne humain endoscopique a été développé qui crée une interface semi-perméable entre le cerveau et le nez en utilisant des greffes muqueuses nasales. Cette méthode permet aux chercheurs d'étudier à la livraison du système nerveux central de la thérapeutique de haut poids moléculaire qui sont par ailleurs exclus par la barrière hémato-encéphalique lorsqu'il est administré par voie systémique.

Résumé

Livraison d'agents thérapeutiques dans le cerveau est entravée par la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui restreint le passage de composés polaires et de haute masse moléculaire et de la circulation sanguine dans le tissu cérébral. Certains succès de livraison directe chez l'homme a été atteint par l'implantation de cathéters transcrânienne; Cependant cette méthode est très invasive et associée à de nombreuses complications. Une alternative moins invasive consiste à doser le cerveau à travers un implanté chirurgicalement, la membrane semi-perméable telle que la muqueuse nasale qui est utilisé pour réparer des défauts de la base du crâne après la chirurgie endoscopique transnasale tumorale d'élimination chez les humains. transfert des médicaments bien que cette membrane serait effectivement contourner la BBB et diffuser directement dans le cerveau et le liquide céphalorachidien. Inspiré par cette approche, une approche chirurgicale chez la souris a été développée qui utilise une membrane muqueuse septale donneur greffé sur un défaut chirurgical Bureau extra. Ce modèle a été démontré efficacementpermettre le passage de composés de haut poids moléculaire dans le cerveau. Depuis de nombreux médicaments candidats sont incapables de traverser la BHE, ce modèle est utile pour effectuer des essais précliniques de nouveaux traitements pour les maladies neurologiques et psychiatriques.

Introduction

Le traitement d'une maladie neurologique ou psychiatrique est gravement entravée par la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui empêche plus de 95% de tous les agents pharmaceutiques potentiels d'atteindre le système nerveux central ^1-3. Par exemple, il a été démontré dérivé des cellules gliales facteur neurotrophique (GDNF) pour être efficace dans le traitement de la maladie de Parkinson lorsqu'il est injecté directement dans le cerveau, mais est inefficace lors de la livraison systémique parce qu'il ne peut pas pénétrer dans le ^4-6 du Bureau.

Nombreux approché ont été développées pour tenter de contourner ce problème. L'amélioration de l'administration systémique de neurotheraputics a été démontrée à l'aide de conjugués médicament contenant des anticorps sélectifs pour des protéines de transport situés sur l'endothélium capillaire cérébral; Mais cette méthode n'a pas été montré pour être applicable à une large gamme de produits pharmaceutiques ^7,8. En outre, l'ouverture osmotique du Bureau a été utilisé cliniqueallié, mais ce procédé souffre d'un dosage systémique du médicament, par opposition à une livraison plus direct vers la région du cerveau d'intérêt ^9. Des efforts considérables ont été mis en optimisation de la prestation transnasal dans l'espoir de cibler directement le cerveau ^10-12. Bien que certains succès ont été réalisés, des résultats probants ont été obtenus seulement pour les médicaments qui possèdent des récepteurs endogènes, tels que l'insuline ^13,14. En outre, le mécanisme de livraison transnasal a été controversée des preuves suggérant entrée indirecte dans le cerveau via l'absorption de neurone olfactif ou par la circulation sanguine ^11. , Livraison transcrânienne directe en utilisant des cathéters implantables ont été réalisés, mais cette procédure est très invasive et associée à de nombreuses complications ^15,16. A ce jour, il n'existe pas de méthode générale, peu invasive pour délivrer des composés de poids moléculaire élevé dans le cerveau.

Présenté ici est une procédure chirurgicale murinqui crée une interface semi-perméable avec le cerveau. Ceci est réalisé en greffant un explant de membrane muqueuse ¹⁷ sur un défaut de craniotomie chirurgicale chez une souris. En utilisant cette procédure, il a été montré que les composés solubles allant jusqu'à 500 kDa peuvent être délivrés dans le système nerveux central (directement dans le parenchyme du cerveau ainsi que dans le liquide céphalo-rachidien) à la fois dans le temps et d'une manière dépendante de la masse moléculaire ^18. Cette méthode de contourner le Bureau est un modèle pour les réparations de défauts de la base du crâne chez l'homme qui utilise des greffons vascularisés muqueuses pour réparer les trous dans le crâne après la chirurgie endoscopique transnasal ^19,20.

Protocole

Avant la chirurgie assurez-vous que toutes les procédures à effectuer sont approuvés par IACUC et des autorités éthiques ou juridiques supplémentaires et utilisent des pratiques de traitement sans cruauté des animaux. Cela comprend l'utilisation des conditions de chirurgie stériles, anesthésier la souris en utilisant IACUC méthode approuvée, la lubrification des yeux de souris avec une pommade vétérinaire pendant la chirurgie, et fournir des soins post-opératoires. Ne pas procéder à une chirurgie s'il ya une question de savoir si les aspects de la procédure sont approuvés. Toutes les procédures effectuées ici ont été approuvés par l'Université institutionnel de protection et d'utilisation des animaux Comité Boston.

1. Préparation des animaux et fournitures chirurgicales

1. Autoclave tout instrument chirurgical qui sera utilisé au cours de la chirurgie.
2. Assurez-vous que toutes les techniques qui doivent être effectués sont approuvés par les organismes de réglementation animaux.

2. Récolte de la muqueuse du greffon

1. Choisissez une souris génétiquement identiques du même âge quela souris expérimentales et euthanasier dans une méthode IACUC approuvé (ici: l'asphyxie isoflurane suivie par dislocation cervicale).
2. Avec des ciseaux chirurgicaux, enlever la peau autour de la région nasale de la tête de la souris exposer le crâne.
3. Avec une perceuse pneumatique, marque avec trois lignes de deux qui flanquent latéralement la région nasale et une troisième en ligne avec les yeux qui relie les deux lignes perpendiculairement.
4. Forer vers le bas sur le ventre, afin de séparer la cloison nasale du tissu environnant. Un chemin plus large permettra d'éviter des dommages à la membrane de la muqueuse mais il sera également plus difficile d'isoler la membrane. Une coupe étroite près de la ligne médiane est recommandé.
5. Utilisez des ciseaux pour couper la cloison libre de tout tissu adhéré et le stocker dans une solution saline stérile. A cette époque, la greffe peut être nettoyé pour enlever les tissus connecté. La situation idéale est d'avoir des membranes muqueuses endommagées exposés des deux côtés de la cloison cartilagineuse. Un grarrière peut fournir membrane pour deux souris à condition que la surface de la membrane est suffisant pour couvrir les sites de craniotomie. Il est recommandé que la greffe est utilisée le plus rapidement possible et le chercheur passe à l'étape 3 dès que le greffon est isolé.

3. L'implantation chirurgicale de greffe muqueuse

1. Utilisant des procédures standard, aseptiques murins chirurgicales, anesthésier et monter une souris dans le cadre stéréologique. Utilisez environ 2% d'isoflurane dans de l'oxygène pur à l'aide d'une machine d'anesthésie rongeur.
2. Immobiliser la souris dans un appareil stéréotaxique avec des barres d'oreille et un support de nez. Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux et frotter le cuir chevelu avec de la bétadine et 75% d'éthanol pendant trois tours. Utilisation de ciseaux ou une tondeuse à cheveux, enlever la fourrure sur la tête. Exposer le crâne avec une lame de rasoir et le niveau de la tête. Effectuer une craniotomie au-dessus de l'emplacement du cerveau qui sera dosé. Par exemple, lorsque vous ciblez le striatum couper un 1,25 mmdiamètre trou circulaire dans le crâne (centré à l'AP: 1,00 mm; ML: 0,88 mm) à l'aide d'un marteau-piqueur. Mouiller la zone percée avec une solution saline stérile et utiliser une lame de rasoir pour enlever le crâne.
3. Retirez délicatement la durée à l'aide de la pointe d'une aiguille. En outre, ceci peut être accompli par l'application d'une quantité minimale de colle pour tissus de la surface durale humide. Une fois que cette couche a durci, le déplacement latéral d'une pointe de lame de rasoir peut être utilisé pour retirer la membrane.
4. Placer la membrane de la muqueuse au-dessus de la surface du cerveau en prenant soin extrême afin de maintenir le côté tourné à l'opposé de l'épithélium de la plaie. Ceci est mieux fait en transférant la totalité de la cloison sur la surface du crâne à proximité du site de craniotomie avec des pincettes. Avec la pointe d'une paire de ciseaux chirurgicaux, tirez la membrane hors du cartilage et sur la surface du crâne et du cerveau. Ne laissez pas dessécher la membrane ou de toucher avec n'importe quel matériau absorbant. La greffe devrait généreusement chevaucher tous les bords osseux de la craniotomie site.
5. Couvrir la greffe d'un morceau stérile de nitrile. Ceci agit de façon à empêcher l'adhérence de la peau pour la greffe au cours de la guérison. Le nitrile doit être suffisamment large pour couvrir la totalité de la membrane de la muqueuse. Coupez membrane excessive si nécessaire. Éviter tout mouvement du nitrile une fois qu'il est entré en contact avec le greffe.
6. Fermer la peau avec un 5-0 suture stérile course et laissez la souris récupérer pendant 3-7 jours avant de passer à l'étape suivante. Prenez soin de ne pas perturber la barrière de nitrile ou la greffe de muqueuse lors de la fermeture de la peau.

4. Administration de dosage Solution

1. Après avoir assuré la souris anesthésiée dans le cadre stéréotaxique, couper le fil de suture avec des ciseaux et enlever l'excès de peau autour du crâne.
2. Retirer la barrière de nitrile et de nettoyer la surface du crâne. Utilisez salines et des cotons-tiges stériles pour nettoyer la zone jusqu'à ce que le greffon est visible. Il peut être nécessaire de couper la greffe avec un rasoir si a augmenté plus grande que la desired surface.
3. Si l'expérience sera de plus de quelques jours, il est sage d'implanter au moins deux vis de crâne de renforcer l'implant de la tête.
4. Placer le puits au-dessus de la greffe de sorte que les bords sont en contact avec le crâne. Appliquer l'adhésif à base de cyanoacrylate à la jonction entre le puits et le crâne. Remplir le puits avec une solution saline stérile et assurez-vous qu'il n'y a pas de fuites. Les puits sont fabriqués à partir des aiguilles de seringues coupées.
5. Appliquer la colle d'os sur le crâne d'assurer le bien en place.
6. Retirer la solution saline à partir du puits avec une pipette. Laver les puits à plusieurs reprises pour vérifier que la colle n'a pas divulgué po Ajouter la solution désirée; dans ce cas, 50 pi de dextran fluorescent est utilisé. On s'attend à ce que les composés solubles dans l'eau d'une polarité similaire se comporteront les mêmes que le dextrane. Délivrance de composés hydrophobes ou de suspensions n'a pas été explorée avec cette méthode.
7. Boucher le haut du puits à l'aide d'un morceau circulaire de nitrile obtenu à l'haut avec de la colle cyanoacrylate. Assurez-vous que la colle n'entre pas en contact avec le contenu des puits.

5. Analyse des transmuqueuse

1. Après que la quantité désirée de temps s'est écoulé, anesthésier les souris et échanger les contenus des puits avec une solution de colorant bleu d'Evan. Ce colorant est utilisé pour vérifier que la greffe était intact.
2. Après 30 min, anesthésier la souris lourdement, enlever la solution de colorant, et euthanasier par décapitation.
3. Supprimer manuellement l'implant et retirer le cerveau à l'aide des ciseaux chirurgicaux. Veillez à maintenir la greffe en place.
4. Une fois retiré, le flash-geler le cerveau dans une solution d'isobutane refroidi dans un bain de glace sèche.
5. Incluez le cerveau dans Optimal Cutting Temperature (OCT) solution et tranche à 50 um.
6. Placer les tranches souhaités directement sur une lame de microscope.
7. L'image de la tranche en utilisant un microscope à fluorescence dès que la solution PTOM ne s'est séché.

Résultats

L'obtention d'un assez grand cloison nasale explant est crucial pour les étapes ultérieures. Ceci peut être réalisé par perçage à l'emplacement sur ​​le crâne de la souris donneuse représenté sur la figure 1a. Coupant le long de ce chemin va produire un explant de la taille suffisante comme le montre la Figure 1b. Si la profondeur de perçage n'est pas assez profond, la greffe sera tronquée et il sera difficile d'obtenir une membrane suffisamment grand...

Discussion

L'étape la plus difficile de la procédure décrite ici est la réussite du transfert d'une membrane muqueuse de taille adéquate sur la surface du cerveau. Cette étape est faite beaucoup plus facile si la cloison nasale récolté est assez grand et bien nettoyée. Si la partie ventrale de la cloison est tronqué, une nouvelle greffe devrait être obtenu. L'angle de perçage doit être perpendiculaire à la tête de la souris pour faire en sorte que la membrane de la muqueuse n'est pas endommagé par l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	Taconic	C57BL/6
Isoflurane	Piramal Healthcare
Student fine scissors	Fine Science Tools	91461-11
Pneumatic drill	MTI Dental	333-CB
Drill bit
Forceps	Fine Science Tools	91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP	Abbott Laboratories	4925
Polystyrene Petri dish	Fisher	08-757-12	for temporarily storing graft
Bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Oxygen/Isoflurane System	SurgiVet	V720100
Temperature Control System	Physitemp	TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument	KOPF	Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators	Fisher	23-400-106
7.5% Providone iodine			Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless	Feather	2976#10
Scalpel handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
3% Hydogen peroxide			for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Needles	Becton, Dickinson and Company	305176	needle tip cut off and used as well
Syringes	Becton, Dickinson and Company	309597
Nitrile gloves	Denville Scientific Inc	G4162	for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder	Fine Science Tools	91201-13
Cyanoacrylate adhesive			commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque	Stoelting	51458
Isobutane (2-methylbutane)	Aldrich	M32631	for dry ice bath
Dry ice