Гетеротопическая слизистой Процедура прививку для прямого доставки лекарств в мозг у мышей

Резюме

Модель мыши эндоскопической основания черепа реконструкции человеческого была разработана, что создает полупроницаемую интерфейс между мозгом и носа с использованием слизистой оболочки носа трансплантатов. Этот метод позволяет исследователей изучать доставку в центральной нервной системе высоких терапевтических молекулярной массой, которые в противном случае исключенных гематоэнцефалический барьер при системном введении.

Аннотация

Доставка терапии в мозг препятствует присутствии гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), который ограничивает прохождение полярных и высокомолекулярных соединений из крови и в ткани головного мозга. Некоторые прямой успех доставка в людях было достигнуто с помощью имплантации транскраниальной катетеров; Однако этот метод является высоко инвазивными и связано с многочисленными осложнений. Менее инвазивные альтернативы можно было бы дозировать мозг через хирургически имплантированных, полупроницаемую мембрану, таких как слизистой оболочки носа, которая используется для ремонта основания черепа дефекты следующие эндоскопической трансназальной опухоли операции по удалению у человека. Передача Drug хотя эта мембрана будет эффективно обойти гематоэнцефалический барьер и диффундировать непосредственно в мозг и цереброспинальной жидкости. Вдохновленный этим подходом, хирургический подход у мышей была разработана, который использует мембраны донором перегородки слизистой насаждаемое над экстракраниального хирургического BBB дефекта. Эта модель, как было показано эффективноразрешить прохождение высокомолекулярных соединений в мозге. Поскольку многочисленные лекарств-кандидатов не способны пересекать ГЭБ, эта модель является ценным для выполнения доклинических испытаний новых методов лечения неврологических и психиатрических заболеваний.

Введение

Лечение неврологических и психиатрических заболеваний сильно затруднено наличием гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), который предотвращает более 95% всех потенциальных фармацевтических средств от достижения на центральную нервную систему ^1-3. Например, глиальных нейротрофического фактора (GDNF), как было показано быть эффективным при лечении болезни Паркинсона при введении непосредственно в мозг, однако не работает, если доставляется системно, поскольку она не может проникнуть через ВВВ ^4-6.

Многочисленные подошел были разработаны, чтобы попытаться обойти эту проблему. Улучшение системной доставки neurotheraputics была продемонстрирована с помощью конъюгатов лекарственного средства, содержащего антитела селективные для транспортных белков, расположенных на эндотелия капилляров головного мозга; Однако этот метод не было показано, что применимо для широкого диапазона фармацевтических ^7,8. Кроме того, осмотическое открытие BBB был использован клиникусоюзник, однако этот метод страдает от системного введения дозы лекарственного средства по сравнению с более прямой доставки к области мозга интереса ^9. Существенные усилия были направлены на оптимизацию доставки трансназальные в надежде направленные непосредственно против мозг ^10-12. Хотя некоторые успехи были достигнуты, убедительные результаты были только получены для препаратов, которые обладают эндогенные рецепторы, такие как инсулин ^13,14. Кроме того, механизм доставки трансназальной был спорным с доказательств того, косвенное вступление в мозг через обонятельный поглощения нейронов или через кровь ^11. Прямая, транскраниальная доставка с помощью имплантируемых катетеров была достигнута, но эта процедура является высоко инвазивными и связано с многочисленными осложнениями ^15,16. На сегодняшний день нет вообще, минимально инвазивный метод, чтобы доставить высокомолекулярных соединений в мозг.

Представлен мышиным хирургическая процедурачто создает интерфейс с полупроницаемой мозга. Это достигается путем прививку на слизистой оболочке эксплантов ¹⁷ над хирургического дефекта в краниотомии мыши. С помощью этой процедуры было показано, что растворимые соединения до 500 кДа могут быть доставлены в центральную нервную систему (непосредственно в паренхиме головного мозга, а также в цереброспинальной жидкости) и в то время, и молекулярная масса зависимым образом ^18. Это метод обхода через ГЭБ представляет собой модель для основания черепа дефектов ремонта в людях, которыми пользуется васкуляризированной слизистой трансплантатов для восстановления отверстия в черепе следующих трансназальной эндоскопической хирургии ^19,20.

протокол

До операции убедитесь, что все процедуры, которые необходимо сделать утверждаются IACUC и любые дополнительные этических или юридических органов и использовать гуманные методы лечения животных. Это включает в себя использование стерильных условий хирургии, анестезии мышь с помощью IACUC утвержден метод, смазочные мышей глаза ветеринара мази во время операции, а также предоставление послеоперационный уход. Не приступайте к операции, если есть какие-либо вопросы, будут ли утверждены аспекты процедуры. Все процедуры, проводимые здесь были утверждены Комитетом Бостонского университета Институциональные уходу и использованию животных в.

1. Подготовка животных и хирургические принадлежности

1. Автоклав все хирургический инструмент, который будет использоваться во время операции.
2. Убедитесь, что все методы, которые должны быть выполнены утверждаются регулирующими органами животных.

2. Заготовка слизистой Graft

1. Выбрал генетически идентичного мышь же возраста, какэкспериментальная мышь и усыпить его в IACUC утвержденного метода (здесь: изофлюран удушья с последующим смещением шейных позвонков).
2. Использование хирургические ножницы, удалить кожу вокруг носа области головы мыши подвергая череп.
3. С пневматической бурильной, марки с тремя линиями два из которых с боков фланге носовой области и третий в соответствии с глазами, которая соединяет две линии перпендикулярно.
4. Детализация снизу, с тем, чтобы отделить носовую перегородку от окружающей ткани. Более широкий путь предотвратит повреждение слизистой оболочки, однако это также сделает его более трудно выделить мембрану. Узкий разрез ближе к средней линии рекомендуется.
5. Используйте ножницы, чтобы вырезать перегородку бесплатно из любой ткани, прикрепленной к его и хранить его в стерильный физиологический раствор. В это время трансплантат могут быть очищены, чтобы удалить подключенное ткани. Идеальная ситуация, чтобы иметь неповрежденные слизистые оболочки подвергается с обеих сторон перегородки хряща. Один гркормовой может поставить мембрану в течение двух мышей при условии, что площадь поверхности мембраны, достаточно, чтобы покрыть краниотомия сайтов. Рекомендуется, чтобы трансплантат используется как можно быстрее и исследователь переходит к этапу 3, как только трансплантат изолированы.

3. Хирургическое Имплантация слизистой оболочки Graft

1. Используя стандартные, асептические мышиных хирургических процедур, анестезии и смонтировать мышь в стереологического кадра. Используйте около 2% изофлуран в чистом кислороде с использованием грызунов наркозный аппарат.
2. Остановите мышь в стереотаксической аппарата с уха баров и держателем носа. Применить глазной мази для глаз и скраб на кожу головы бетадином и 75% этанола в течение трех раундов. Использование либо ножницы или волос триммер, снимите шерсть на голове. Expose череп с лезвием бритвы и выравнивания положения головы. Выполнение трепанацию черепа выше местоположения мозга, которые будут дозированного. Например, при ориентации стриатуме вырезать 1,25 ммДиаметр круглое отверстие в черепе (с центром в ЗС: 1.00 мм; ML: 0,88 мм) с помощью отбойного молотка. Смочить пробурена область стерильным физиологическим раствором и использовать лезвие, чтобы удалить череп.
3. Осторожно снимите твердую мозговую оболочку, используя кончик иглы. Кроме того, это может быть достигнуто с применением минимального количества тканевого адгезива на влажной поверхности твердой мозговой оболочки. После этого слой затвердеет, боковое движение с наконечником бритвенных лезвий может быть использован, чтобы удалить мембрану.
4. Поместите мембрану слизистой оболочки над поверхностью мозга, принимая крайнюю осторожность, чтобы сохранить эпителиальных стороне, обращенной от раны. Это лучше всего делать путем передачи всю перегородки на поверхности черепа, прилегающей к краниотомии сайта с помощью пинцета. С помощью кончика пары хирургических ножниц, потяните мембрану от хряща и на черепа и головного мозга поверхности. Не позволяйте мембрана высыхает и не касайтесь его любой абсорбирующим материалом. Трансплантат должен щедро перекрываются все костные края краниотомии сITE.
5. Накройте трансплантата со стерильным части нитрила. Это действует, чтобы предотвратить прилипание к коже трансплантата во время лечения. Нитрил должна быть достаточно большой, чтобы покрыть всю слизистую оболочку. Обрезать чрезмерное мембрану при необходимости. Избегайте движения нитрила, как только он вступает в контакт с трансплантата.
6. Закройте кожи с управлением 5-0 стерильной шва и пусть мышь восстановить в течение 3-7 дней, прежде чем приступить к следующему шагу. Будьте осторожны, не возмущают нитрильного барьер или трансплантата слизистой во время закрытия кожи.

4. Администрация дозирования раствора

1. После обеспечения наркозом мышь в стереотаксической рамы, сократить шов с ножницами и удалить лишнюю кожу вокруг черепа.
2. Снимите нитрильного барьер и очистить поверхность черепа. Используйте стерильного физиологического раствора и ватные тампоны для очистки области, пока трансплантат не видно. Это может быть необходимо, чтобы сократить трансплантат бритвой если выросло больше, чем Desired площадь поверхности.
3. Если эксперимент будет больше, чем на несколько дней, имеет смысл внедрить как минимум два винта черепа, чтобы укрепить голову имплантат.
4. Поместите значительно выше трансплантата так, чтобы края находятся в контакте с черепа. Применить цианакрилатного клея на стыке между скважиной и черепа. Заполните колодец стерильным физиологическим раствором и убедитесь, что нет никаких утечек. Уэллс сделаны из вырезать шприцев игл.
5. Применить костного цемента на черепе, чтобы закрепить хорошо на месте.
6. Извлеките солевой раствор из скважины с помощью пипетки. Вымойте хорошо несколько раз, чтобы убедиться, что клей не просочилась на сайт Добавить искомое решение; в этом случае 50 мкл флуоресцентного декстрана используется. Ожидается, что водорастворимые соединения сходной полярности будет вести себя так же, как декстран. Доставка из гидрофобных соединений или суспензий не были изучены с помощью этого метода.
7. Закрывают верхнюю часть скважины с помощью круговой кусок нитрила, прикрепленный кначалу помощью цианакрилатного клея. Убедитесь, что клей не вступают в контакт с содержимым также.

5. Анализ трансмукозной доставки

1. После того, как необходимое количество времени прошло, обезболить мышь и обмена содержимым также с раствором синего красителя Эвана. Этот краситель используется для проверки того, что трансплантат был цел.
2. Через 30 мин, обезболить мышь тяжело, удалить раствор красителя, и усыпить через обезглавливание.
3. Вручную удалите имплантат и удалить мозг, используя хирургические ножницы. Будьте осторожны, чтобы сохранить трансплантат на месте.
4. После удаления флэш-замораживание мозга в растворе изобутана охлаждают в бане с сухим льдом.
5. Вставить мозг в оптимального раскроя температура раствора (OCT) и ломтик на 50 мкм.
6. Поместите необходимое ломтики непосредственно на предметное стекло микроскопа.
7. Изображение срез с использованием цветения микроскоп, как только решение октябре высохнет.

Результаты

Получение достаточно большой носовой перегородки эксплантов имеет решающее значение для последующих стадиях. Это может быть достигнуто путем бурения на месте на черепа мыши-донора в показано на фиг.1А. Режущий по этому пути будет производить эксплантов достаточного размера, ...

Обсуждение

Самым сложным этапом процедуры, описанной в настоящем документе, успешная передача из мембраны адекватного размера слизистой на поверхность мозга. Этот шаг сделан значительно легче, если собирают носовой перегородки достаточно большой и убираются хорошо. Если брюшной участок перего?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	Taconic	C57BL/6
Isoflurane	Piramal Healthcare
Student fine scissors	Fine Science Tools	91461-11
Pneumatic drill	MTI Dental	333-CB
Drill bit
Forceps	Fine Science Tools	91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP	Abbott Laboratories	4925
Polystyrene Petri dish	Fisher	08-757-12	for temporarily storing graft
Bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Oxygen/Isoflurane System	SurgiVet	V720100
Temperature Control System	Physitemp	TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument	KOPF	Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators	Fisher	23-400-106
7.5% Providone iodine			Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless	Feather	2976#10
Scalpel handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
3% Hydogen peroxide			for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Needles	Becton, Dickinson and Company	305176	needle tip cut off and used as well
Syringes	Becton, Dickinson and Company	309597
Nitrile gloves	Denville Scientific Inc	G4162	for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder	Fine Science Tools	91201-13
Cyanoacrylate adhesive			commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque	Stoelting	51458
Isobutane (2-methylbutane)	Aldrich	M32631	for dry ice bath
Dry ice