Heterotope Mucosal-Transplantationsverfahren für Direkt Drug Delivery zum Gehirn bei Mäusen

Zusammenfassung

Ein Maus-Modell der menschlichen endoskopische Schädelbasis Wiederaufbau entwickelt worden, das eine halbdurchlässige Schnittstelle zwischen Gehirn und Nase mit Nasenschleimhauttransplantate schafft. Dieses Verfahren ermöglicht es den Forschern, die Lieferung an das zentrale Nervensystem von hohem Molekulargewicht Therapeutika, die sonst durch die Blut-Hirn-Schranke ausgeschlossen sind, wenn sie systemisch verabreicht zu studieren.

Zusammenfassung

Abgabe von Therapeutika in das Gehirn durch die Gegenwart von Blut-Hirn-Schranke (BBB), die den Durchtritt von polaren und hochmolekulare Verbindungen aus dem Blut und in Hirngewebe beschränkt behindert. Einige direkte Lieferung Erfolg bei den Menschen wurde durch Implantation von Kathetern transkranielle erreicht worden; jedoch ist dieses Verfahren hochinvasiv und mit zahlreichen Komplikationen verbunden. Eine weniger invasive Alternative wäre das Gehirn durch eine chirurgisch implantiert, semipermeable Membran, wie die Nasenschleimhaut, die verwendet wird, um Defekte zu reparieren Schädelbasis folgende endoskopische transnasale Tumorentfernung Operation beim Menschen zu dosieren. Arzneimittelübertragungs wenn diese Membran würde effektiv umgehen die BBB und diffundieren direkt in das Gehirn und in der cerebrospinalen Flüssigkeit. Inspiriert von diesem Ansatz wurde ein chirurgischer Ansatz bei Mäusen entwickelt, die ein Spender Septum-Schleimhaut über eine extrakranielle chirurgischen BBB Defekt eingepflanzt verwendet. Dieses Modell hat sich gezeigt, effektivden Durchgang von hochmolekularen Verbindungen in das Gehirn. Da zahlreiche Wirkstoff-Kandidaten nicht in der Lage über den BBB sind, ist dieses Modell für die Durchführung wertvolle präklinische Prüfung von neuen Therapien für neurologische und psychiatrische Erkrankungen.

Einleitung

Die Behandlung von neurologischen und psychiatrischen Krankheiten ist durch das Vorhandensein der Blut-Hirn-Schranke (BBB), die mehr als 95% aller potentiellen pharmazeutischen Wirkstoffen vom Erreichen des zentralen Nervensystems verhindert ^1-3 behindert. Beispielsweise Gliazellen stammenden neurotrophen Faktor (GDNF) gezeigt wurde, wirksam bei der Behandlung der Parkinson-Krankheit, wenn sie direkt in das Gehirn injiziert wird, ist jedoch unwirksam, wenn sie systemisch zugeführt, weil es die BBB ^4-6 nicht durchdringen kann.

Zahlreiche fahren wurden entwickelt, um zu versuchen, dieses Problem zu umgehen. Verbesserung der systemischen Verabreichung von neurotheraputics wurde durch die Verwendung Wirkstoff-Konjugate Antikörper selektiv für Transportproteine ​​auf das Gehirn Kapillarendothels befindet haltigen nachgewiesen worden; aber diese Methode ist nicht gezeigt worden anwendbar für eine breite Palette von Arzneimitteln ^7,8 sein. Zusätzlich osmotische Öffnung der BHS ist verwendet worden, KlinikVerbündeter, aber diese Verfahren leidet systemische Medikamentendosierung im Gegensatz zu einer direkten Lieferung an den Hirnregion von Interesse ^9. Große Sorgfalt wurde in die Optimierung transnasalen Lieferung in der Hoffnung, sich direkt auf das Gehirn ^{10 bis 12} gesetzt. Obgleich ein gewisser Erfolg erzielt worden ist, sind aussagekräftige Ergebnisse nur für Medikamente, die endogene Rezeptoren wie Insulin ^13,14 aufweisen, erhalten wurde. Außerdem ist der Mechanismus der transnasalen Lieferung ist umstritten, Anhaltspunkte dafür, mit indirekter Einführung in das Gehirn über olfaktorische Neuron-Aufnahme oder über die Blutbahn ^11. Direkte Zustellung mit transcranial implantierbaren Kathetern erreicht wurde, jedoch ist dieses Verfahren hochinvasiv und mit zahlreichen Komplikationen ^15,16 verbunden. Bis heute gibt es keine allgemeine, minimal invasiven Verfahren zu hochmolekularen Verbindungen in das Gehirn zu liefern.

Hierin präsentierten ein muriner chirurgische Verfahrendas erzeugt eine halbdurchlässige Grenzfläche mit dem Gehirn. Dies wird durch eine Schleimhaut-Transplantations Explantat ¹⁷ über eine chirurgische Schädeldefekt in einer Maus durchgeführt. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde gezeigt, daß lösliche Verbindungen bis zu 500 kDa in das zentrale Nervensystem (direkt in Gehirnparenchym als auch in Liquor) sowohl in einer Zeit und einem Molekulargewicht abhängigen Weise ¹⁸ geliefert werden. Diese Methode der Umgehung des BBB ist ein Modell für Schädelbasisdefekt Reparaturen in den Menschen, die gefäßSchleimhautTransplantationen verwendet, um Löcher in den Schädel zu reparieren folgenden transnasalen endoskopische Chirurgie ^19,20.

Protokoll

Vor der Operation sicherzustellen, dass alle Verfahren, die getan werden durch IACUC und alle zusätzlichen ethischen oder rechtlichen Behörden und benutzen humane Tierbehandlungspraktiken. Dies schließt mit sterilen Operationsbedingungen, betäuben die Maus mit IACUC zugelassenen Methode, Schmier Mäuse Augen mit Salbe Tierarzt während der Operation und die Bereitstellung postoperativen Versorgung. Sie nicht mit der Operation fortzufahren, wenn es irgendeine Frage, ob Aspekte des Verfahrens werden genehmigt. Alle Verfahren durchgeführt, hier wurden von der Boston University Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Vorbereitung der Tiere und Surgical Supplies

1. Autoklav alle chirurgischen Instruments, die während der Operation verwendet wird.
2. Sicherstellen, daß alle Techniken, die durchgeführt werden sollen, werden von den Zulassungsbehörden zugelassenen Tier.

2. Ernten der Schleimhauttransplantat

1. Wählen Sie einen genetisch identischen Maus von ähnlichen Alter wiedie experimentelle Maus und einschläfern es in einer IACUC zugelassenen Methode (hier: Isofluran Ersticken durch Genickbruch folgte).
2. Mit chirurgische Scheren, entfernen Sie die Haut um die Nasenregion von Maus-Kopf Aussetzen des Schädels.
3. Mit einem Presslufthammer, Filter mit drei Leitungen, von denen zwei seitlich flankieren den Nasenbereich und eine dritte im Einklang mit den Augen, die senkrecht die beiden Leitungen verbindet.
4. Drill-down ventral um die Nasenscheidewand aus dem umgebenden Gewebe zu trennen. Ein breiterer Weg wird eine Beschädigung der Schleimhaut zu verhindern, jedoch wird es auch erschwert, um die Membran zu isolieren. Ein schmaler Schnitt näher an der Mittellinie wird empfohlen.
5. Mit einer Schere, um das Septum frei von Gewebe, um es halten schneiden und speichern sie in einer sterilen Kochsalzlösung. Zu diesem Zeitpunkt kann das Transplantat bis gereinigt werden, um angeschlossene Gewebe zu entfernen. Die ideale Situation besteht darin, dass unbeschädigte Schleimhautmembranen auf beiden Seiten des Knorpels Septum ausgesetzt. Ein grachtern Membran kann für zwei Mäuse zuzuführen die Oberfläche der Membran ausreichend ist, um die Kraniotomie Gebiete umfassen. Es wird empfohlen, dass das Implantat so schnell wie möglich verwendet und die Forscher geht, sobald das Transplantat isoliert Schritt 3 fort.

3. Chirurgische Implantation von Schleimhauttransplantat

1. Mit Standard-, aseptische murinen chirurgischen Verfahren, betäuben und montieren eine Maus in der stereo Rahmen. Verwenden Sie etwa 2% Isofluran in reinem Sauerstoff mit einem Nagetier Anästhesiegerät.
2. Immobilisieren die Maus in einem stereotaktischen Apparat mit Ohr Bars und ein Nasenhalter. Bewerben Augensalbe auf die Augen und reiben Sie die Kopfhaut mit betadine und 75% Ethanol für drei Runden. Entweder mit einer Schere oder einem Haarschneider, entfernen Sie das Fell auf dem Kopf. Expose den Schädel mit einer Rasierklinge und ebnen den Kopf. Führen Sie eine Kraniotomie oberhalb der Stelle des Gehirns, die dosiert werden. Zum Beispiel, wenn gezielt den Striatum schnitt ein 1,25 mmDurchmesser kreisrundes Loch in den Schädel (bei AP zentriert: 1.00 mm, ML: 0,88 mm) mit einem Presslufthammer. Befeuchten Sie die gebohrt Bereich mit steriler Kochsalzlösung und mit einer Rasierklinge, um den Schädel zu entfernen.
3. Entfernen Sie vorsichtig die Dura mit der Spitze einer Nadel. Darüber hinaus kann dies durch Auftragen einer minimalen Menge an Gewebekleber auf das feuchte duralen Oberfläche erzielt werden. Sobald diese Schicht ausgehärtet ist, kann eine seitliche Bewegung mit einer Rasierklinge Spitze verwendet werden, um die Membran zu entfernen.
4. Legen Sie die Schleimhaut über der Hirnoberfläche unter äußerster Vorsicht, um die Seite zu halten Epithel abgewandten aus der Wunde. Dies wird am besten durch die Übertragung der gesamten Scheidewand an der Oberfläche des Schädels benachbart zu der Kraniotomie Seite mit einer Pinzette durchgeführt. Mit der Spitze eines chirurgische Schere, ziehen die Membran aus der Knorpel und auf den Schädel und Hirnoberfläche. Lassen Sie sich nicht die Membran austrocknen oder berühren sie mit jedem Material aufnehmen. Das Transplantat sollte großzügig überlappen alle knöchernen Rändern der Schädel site.
5. Decken Sie das Transplantat mit einer sterilen Stück Nitril. Dies dient dazu, die Haftung der Haut während der Heilung des Transplantats zu verhindern. Das Nitril muss groß genug sein, um die gesamte Schleimhaut abzudecken. Trim übermäßige Membran, wenn nötig. Vermeiden Bewegung des Nitrils, sobald es in Kontakt mit dem Transplantat zu kommen.
6. Schließen Sie die Haut mit einer Lauf 5-0 steriles Naht und lassen Sie die Maus wieder für 3-7 Tage, bevor Sie zum nächsten Schritt. Achten Sie darauf, die Nitril-Schranke oder die Schleimhaut-Transplantat bei Hautverschluss stören.

4. Administration of Dosing Lösung

1. Nach dem Befestigen des narkotisierten Maus in der stereotaktischen Rahmen, schneiden Sie den Faden mit Schere und entfernen überschüssige Haut um den Schädel.
2. Entfernen Sie die Nitril-Schranke und reinigen Sie die Oberfläche des Schädels. Verwenden steriler Kochsalzlösung und Wattestäbchen zu reinigen Sie den Bereich, bis das Transplantat sichtbar ist. Es kann notwendig sein, um das Transplantat mit einer Rasierklinge geschnitten hat, wenn größer als der d gewachsenesired Oberfläche.
3. Wenn das Experiment länger als ein paar Tage zu sein, ist es ratsam, mindestens zwei Schrauben Schädel implantieren, um den Kopf Implantat zu verstärken.
4. Zeigen die weit über dem Transplantat so dass die Kanten in Kontakt mit dem Schädel. Gelten Cyanacrylat-Klebstoff an der Verbindungsstelle zwischen der Wanne und dem Schädel. Füllen Sie die gut mit steriler Kochsalzlösung und stellen Sie sicher, dass keine Leckagen. Wells von Spritzennadeln Schnitt gemacht.
5. Bewerben Knochenzement auf dem Schädel, die gut zu befestigen.
6. Entfernen Sie die Kochsalzlösung aus der gut mit einer Pipette. Die mehrmals gut waschen, um zu überprüfen, dass Klebstoff nicht einge durchgesickert Fügen Sie die gewünschte Lösung; in diesem Fall 50 ul fluoreszierenden Dextran verwendet. Es wird erwartet, dass die wasserlöslichen Verbindungen von ähnlicher Polarität die gleiche wie Dextran verhalten. Lieferung von hydrophoben Verbindungen oder Suspensionen ist mit diesem Verfahren nicht untersucht worden.
7. Verschließen Sie die Oberseite der auch durch die Verwendung eines kreisförmiges Stück aus Nitril auf die gesicherttop mit Cyanacrylatklebstoff. Sicherzustellen, dass der Klebstoff nicht in Kontakt mit den Wells kommen.

5. Analyse Transmucosale Liefer

1. Nachdem die gewünschte Menge Zeit vergangen ist, betäuben die Maus und die Inhalte auch mit einer Lösung von Evans-Blau-Farbstoff auszutauschen. Dieser Farbstoff wird verwendet, um zu überprüfen, dass das Transplantat war intakt.
2. Nach 30 min, betäuben die Maus stark, entfernen Sie die Farbstofflösung und einschläfern über Enthauptung.
3. Manuelles Entfernen des Implantats und entfernen Sie das Gehirn mit chirurgischen Schere. Seien Sie vorsichtig, um das Transplantat an Ort und Stelle zu halten.
4. Einmal entfernt, Flash-einfrieren das Gehirn in einer Lösung von Isobutan gekühlt in einem Trockeneis-Bad.
5. Betten Sie das Gehirn in Optimale Schneidtemperatur (OCT)-Lösung und Scheibe bei 50 um.
6. Zeigen die gewünschten Scheiben direkt auf einem Objektträger.
7. Bild der Scheibe mit einem Fluoreszenz-Mikroskop, sobald der Oktober-Lösung getrocknet ist.

Ergebnisse

Erhalten einer ausreichend großen Nasenscheidewand-Explantat ist entscheidend für die weiteren Schritte. Dies kann durch Bohren an der Stelle der in Fig. 1a gezeigten Spendermaus Schädel durchgeführt werden. Schneiden entlang diesem Weg wird ein Explantat von ausreichender Größe zu erzeugen, wie in Fig. 1b gezeigt. Wenn die Bohrtiefe ist nicht tief genug ist, wird das Transplantat abgeschnitten sein, und es wird schwer sein, eine ausreichend große Membran, um die Gehirnoberfläch...

Diskussion

Der schwierigste Schritt der hier beschriebenen Verfahren ist der erfolgreiche Transfer von einer genügend großen, Schleimhaut auf der Hirnoberfläche. Dieser Schritt wird wesentlich erleichtert, wenn die geerntet Nasenscheidewand ist groß genug und gut gereinigt. Wenn der ventralen Abschnitt der Scheidewand abgeschnitten wird, sollte eine neue Transplantat erhalten werden. Der Bohrwinkel sollte senkrecht zu der Maus Kopf sein, um sicherzustellen, dass die Schleimhautmembran nicht durch den Bohrer beschädigt wird. W...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	Taconic	C57BL/6
Isoflurane	Piramal Healthcare
Student fine scissors	Fine Science Tools	91461-11
Pneumatic drill	MTI Dental	333-CB
Drill bit
Forceps	Fine Science Tools	91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP	Abbott Laboratories	4925
Polystyrene Petri dish	Fisher	08-757-12	for temporarily storing graft
Bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Oxygen/Isoflurane System	SurgiVet	V720100
Temperature Control System	Physitemp	TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument	KOPF	Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators	Fisher	23-400-106
7.5% Providone iodine			Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless	Feather	2976#10
Scalpel handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
3% Hydogen peroxide			for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Needles	Becton, Dickinson and Company	305176	needle tip cut off and used as well
Syringes	Becton, Dickinson and Company	309597
Nitrile gloves	Denville Scientific Inc	G4162	for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder	Fine Science Tools	91201-13
Cyanoacrylate adhesive			commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque	Stoelting	51458
Isobutane (2-methylbutane)	Aldrich	M32631	for dry ice bath
Dry ice