密闭静态和流动胶体聚合物混合物的共聚焦成像

摘要

共聚焦显微术用于图像的静态和流动的胶体聚合物的混合物，这是研究作为模型系统的吸引力悬浮液。图像分析算法来计算结构和动态度量用于测量由于几何约束变化的胶体粒子。

摘要

密闭胶体悬浮有吸引力间相互作用的行为是合理设计的材料的定向组件^1-3，给药^4，改进的烃采收^5-7，和对能量存储装置⁸流动的电极是至关重要的。含有荧光性胶体和非吸附性的聚合物悬浮液吸引人的模型系统中，如回转聚合物半径分别向范围和颗粒间的吸引力的强度，粒子半径控制聚合物的浓度和比例。通过调节聚合物的性质和胶体的体积分数，胶体液，簇的液体，凝胶，晶体，和眼镜可以得到^9。 共聚焦显微镜，荧光显微镜的一个变型中，允许一个光学透明和荧光样品将被成像以高空间和在三维空间中的时间分辨率。在该技术中，一个小针孔或由属于显微镜的光学系统的焦点容积之外的样品区域狭缝块所发出的荧光。其结果是，样品在焦平面只有一个薄截面进行成像。此技术特别适合于单粒子尺度来探测在稠密的胶体悬浮液的结构和动力学：颗粒是足够大，以利用可见光来解决和扩散足够缓慢以商业共聚焦系统¹⁰的典型的扫描速度被捕获。在扫描速度和分析算法的改进也使流动的悬浮液 ^11-16,37 定量共聚焦成像。在本文中，我们演示了激光共聚焦显微镜实验来探测局限相行为和胶体聚合物混合物的流动性能。我们先准备科尔是密度和折射率的OID的聚合物的混合物相匹配。接下来，我们提出一个标准协议，用于在不同的约束薄楔形细胞成像静态密集的胶体聚合物的混合物。最后，我们展示了一个协议，用于微流在成像胶体聚合物的混合物。

引言

本文演示了静态和流动的密闭胶体聚合物中二和混合三个维度及（b）粒子跟踪和相关的合成图像的分析，以获得对相态和流动性的定量信息（一）共焦成像。

胶体悬浮液有吸引力的粒子间的相互作用似乎无处不在的技术应用，材料的定向组装^1-3，给药^4，提高油气采收率^5-7，和储能^8。这些应用的一个共同特点是，粒子必须通过精细的几何形状，如喷嘴，打印头，微通道，或者多孔介质中流动，和/或成型为薄膜或棒。用于探测在密闭的几何形状，包括电子显微镜^17,18，X射线显微镜^，19，和激光衍射米微米大小的胶体结构的技术镜检^20，可用于测量在微尺度粒子的结构和动力学。这些技术，然而，不允许访问的单个颗粒，从该结构和动态度量可以计算为直接比较数值模拟^21,22的轨迹。

共聚焦显微镜的荧光显微镜的一个变种，它使的荧光样品的薄切片成像。对于胶体科学^10，此技术是用于深内稠密的悬浮液或在三维成像中特别有用。粒子跟踪算法²³适用于二维或三维的时间序列共聚焦显微照片产生所有可见的粒子的运动轨迹。其结果是，激光共聚焦显微镜和粒子跟踪的组合已被用于研究的相行为，结构和胶态悬浮液的动力学，包括有序的晶体^24-27和紊乱海关眼镜^28-31和^32-35的凝胶。

其他图像分析算法可以应用于从时间序列的共聚焦显微照片测量粒子动力学。例如，扩散粒子动力学可以通过分析利用共聚焦微分动力显微镜³⁶的强度随时间的波动进行研究。当粒子的位移比颗粒间间距大，根据粒子图像测速^38-40图像相关性³⁷可以应用到测量颗粒的速度分布。的跟踪和相关算法相结合，使胶体动力学在经历缓慢和快速流动^11-16,41-45系统进行测量。

我们用胶体聚合物混合物作为有吸引力的胶体悬浮液⁹款车型。在这些混合物中，颗粒间的吸引力电位的范围和强度是通过比率控制回转半径聚合物与颗粒半径与聚合物和静电斥力的浓度通过添加一价有机盐⁴⁶进行控制。因为颗粒间的相互作用，可以仔细调整，这些混合物的凝固进行了广泛研究以共焦显微镜^34,47-51。

在这里，我们展示了共焦成像的静止和流动的胶体聚合物混合物和图像分析^37，其中胶体体积分数为Φ保持固定= 0.15，即探头禁闭的相行为和这些混合物的流动性能的影响。这些技术广泛适用于颗粒系统，是折射率匹配的，并且其中的颗粒和/或溶剂可以标记有荧光染料。

研究方案

的胶体聚合物的混合物1。准备

注意：该协议使用的聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA）粒子，空间稳定使用聚（12 - 羟基硬脂酸）和标记有荧光染料（如尼罗红，若丹明B，或荧光素），合成了以下的标准即配方^52。

1. 准备3:1 w / w的环己基溴化铵（CXB​​）和十氢萘（DHN）作为股票溶剂的混合物。此混合物几乎与折射颗粒的密度和索引。添加的有机盐，四丁基氯化铵^{（TBAC）46，}向溶剂中在1.5 mM的浓度，以部分屏幕上的粒子的电荷。
2. 精确地确定粒子的密度，制备悬浮液在近似颗粒体积分数Φ=中的CXB 0.10：DHN溶剂。离心悬浮液，在800×g离心75分钟，并加CXB或DHN滴加提高浮力匹配。在这些实验中，聚甲基丙烯酸甲酯粒子的密度测定为ρ=1.223克/毫升。
3. 制备浓缩的纸浆悬浮液的PMMA粒子（此处，Φ= 0.40）中的CXB：DHN溶剂混合物。
4. 备中的CXB线性聚苯乙烯（PS）的浓溶液：DHN溶剂混合物。这里，分子量M PS的解_{w≈3000000（}回转R _G = 15nm的半径）的制备在浓度_C P≈50毫克/毫升。
5. 混合颗粒，聚合物和溶剂的原料混合物的适当的权重，以制定悬浮在粒子和聚合物的所需浓度。
   注意：在这里，单分散颗粒的悬浮液制备成胶体恒定体积分数Φ= 0.15和可变的聚合物浓度中的自由体积⁵³ C _P = 0-25毫克/毫升，并bidispersed含有两种尺寸的胶体颗粒的悬浮液，瓦特第i个大小各带有一个独特的荧光标记，制备固定于胶体总体积分数Φ=小颗粒为0.15，体积分数比r = 0.50，和聚合物浓度为5或25毫克/毫升的自由体积。
6. 后各悬浮液制备中，添加CXB或DHN溶液并离心样品在800×g离心至少75分钟，以确认该悬浮液中的颗粒和簇保持浮力匹配。
7. 平衡所有样品至少24小时前成像实验。

2，静态实​​验样品：相行为

1. 要确定体相行为，制造玻璃盖玻片（ 图1a）矩形腔。用于本研究中的胶体聚合物的混合物，厚度为h = 1毫米（通过显微镜载玻片的厚度设定）腔室给散装的行为。
2. 要访问一个单一的显微镜实验多接产，制作薄楔形形腔，使用一个单一的盖玻片作为在一个楔形的垫片（ 图1b）。该腔室的开口角度为<0.5°，以便在视图中的单个字段的壁非常接近平行。一位代表室允许访问限制厚度为h = 6〜> 100微米。
3. 构建室上盖玻片基地成像于倒置显微镜和密封用紫外线固化型环氧树脂，它不会在CXB-DHN溶剂混合物中溶解。
4. 使用共聚焦显微镜图像样本。这个协议示范成像与连接到倒置显微镜配备有数值孔径的100X油镜NA = 1.40的线扫描共焦。
5. 使用激光源激发的染料。这里波长λ= 491或561 nm的用于激发荧光素和若丹明/尼罗红染料，分别。
6. 在点扫描系统，通过快速扫描整个样品的焦点（在x生成图像y平面）使用共聚焦软件。的512个像素的二维图像×512像素，覆盖大约50微米×50微米，可以在1/32秒来获得。通过平均多个图像或增加采集时间提高了图象质量。
7. 找到该腔室的底部（Z = 0），例如通过集中颗粒附着到其底部。在这种设置中，高度（Z）增加而增加重点放到室。
8. 作为一个例子，通过在腔室的中间平面获得的2-D的时间序列图像（在xy平面内）表征的颗粒的动力学限制的效果。在一个典型的实验中，尺寸为500的图像512像素×512像素，在1帧/秒的帧速率（时间间隔ΔT= 1秒）获取。
9. 作为第二个例子，通过获得的三维图像系列（的x，y，z）的表征颗粒的3-D结构。在一个典型的实验中，二维图像（512像素×512像素）的在腔室中的多个Z轴位置获得的，与Δ狕的恒定间距=0.2μm的由压电设置连续的图像间。卷叠覆盖厚度为h = 30微米因此包含151的图像。
10. 找到并使用用IDL编写^{23,54-56，MATLAB 57,58，59}的LabView或Python ⁶⁰粒子跟踪软件随着时间的推移跟踪颗粒在2-D或3-D。这些算法通常允许颗粒的中心被内40-50 nm的解决。成功的粒子跟踪要求粒子运动少于连续帧之间的粒子间距。
11. 从粒子的位置，计算结构和动态指标。这里显示三个方便的指标是3-D对关联函数^{g（r）61，2-D}均方位移^{（MSD）58,62，}和面包车霍夫相关函数_G S的2-D的自我的一部分（ ^X，T）58。后两种度量也可以计算出在3-D。

3，重排实验：流动性能

1. 使用具有正方形横截面（100微米×100微米），其固定到特氟隆管的玻璃微毛细管制作一个简单的流动池。使用玻璃盖玻片上，以支持所述毛细管和提供机械刚性，如图所示，在图7中的原理图。
2. 加载胶体的聚合物混合物制成的玻璃注射器中。连接注射器的注射器泵或气动流体分配系统。
3. 安装流动池安装到倒置显微镜。保持注射器，流通池和出口在相同的高度，以尽量减少重力对流量分布的影​​响。
4. 过流动池的体积流量（对于注射泵）或所施加的压力（压力盒）控制悬浮液的流速。悬挂在微通道的平均速度还取决于苏spension配方。在正方形微这里测得的最大流速的典型值是200-2,000微米/秒。
5. 在流，获得一个二维共焦时间序列的帧速率。这里，尺寸为500的图像512像素×512像素，32帧/秒获取的（时间间隔ΔT = 1/32秒）在不同高度上的微通道的底部（z = 0的微米）以上，从Z = 5 - 50微米。每个图像包括大约一半的微通道的横向尺寸（Y），如图所示在嵌入到图7。如果颗粒呈现为椭圆形，增加采集的帧速率。
6. 在静态实验，找出使用标准算法，用于定位和跟踪的IDL或MATLAB粒子在二维颗粒。缓慢流动，在这种粒子移动小于帧之间的平均粒子间距，使用跟踪算法得到的轨迹。
7. 利用图像的相关性为钙乌拉特快速流动的速度分布。
   1. 细分图象划分为恒定高度（y）的沿流动方向的水平的图像（X）。对于两个连续的图像I _1（X，Y）和I _2（X，Y）的一个因素ΔX转移后的图像，然后计算之间的I _1（X，Y）的互协方差和I _2（X +ΔX， Y）。
   2. 确定ΔX值，最大限度地提高各个图像对之间的互协方差以获得在每个横向位置 y的平均对流速度的直方图的峰值位置。如果这种分配不是强见顶，以更快的帧速率采集图像。

结果

为了证明共聚焦成像和粒子跟踪，我们调查坐月子对胶体聚合物混合物^63-65相行为的影响。这些实验的胶体粒径为2 = 0.865微米。胶体体积分数固定为Φ= 0.15和聚合物 c _p的浓度变化为0至23.6毫克/毫升。代表性的共聚焦图像显示在图2中 ^63，左边的列。使用跟踪算法得到的颗粒归仓，我们计算出的代表结构和动态指标，包括对相关函数（ ?...

讨论

胶态悬浮液被广泛地研究了作为密闭相行为模型，由于微米级的胶体颗粒具有比原子和分子显著缓慢的动态特性，因此可以容易地成像并随时间跟踪^10。对于这些基础研究，了解粒子间的景点上局限于相行为的影响提供了机会，探索，如毛细管冷凝和蒸发^21,22,67现象。此外，密闭吸引力的悬浮液出现无处不在工业和技术的应用。对于这些应用的研究，了解悬浮液制剂的有关密闭流?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyclohexyl bromide	Sigma Aldrich	135194	CAS Number  108-85-0, Molecular wt. = 163.06, Used in stock solvent
Decahydronapthalene	Sigma Aldrich	D251	CAS Number 91-17-8, Molecular wt. = 138.25, Used in stock solvent
Nile Red	Sigma Aldrich	72485	Fluorescent dye
Fluorescein 5(6)-isothiocyanate	Sigma Aldrich	F3651	Fluorescent dye
Rhodamine B	Sigma Aldrich	83689	Fluorescent dye
Dynamic Light Scattering	Brookhaven Instruments	BI-APD	DLS equipment used for particle size measurement
Polystyrene	Varian/Agilent	PL20138-23	Polystyrene (polymer) for inducing depletion attraction
Tetrabutyl(ammonium chloride) (TBAC)	Sigma Aldrich	86870	monovalent salt
UV Adhesive	Norland Adhesive	NOA 68T	Part Number 68T01 (UV cured adhesive)
VT Eye	Visitech	VT Eye	confocal scanner
VT Infinity	Visitech	VT Infinity	confocal scanner
Microscope	Leica	DMI3000B	Inverted Microscope
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall ST 16	1-5,000 rpm
Teflon tubing	smallparts	SLTT 26-72	Zeus PTFE Sublite Wall Tubing 26 AWG 0.016" ID x 0.003" Wall
Epoxy	Devcon	DA051	5 min epoxy
Syringe	Micromate/Cadence	5004	glass syringe with metal luer lock tip
Syringe tips	Nordson	7018462	32 GA precision tips
Syringe pump	New Era Pump system Inc.	NE1002X	Programmable microfluidic pump (syringepump.com)
Weigh balance	Mettler Toledo	AB204-S	0.0001-220 g
PMMA particles	synthesized		poly(methylmethacrylate) colloidal particles