Imagen confocal de Confinados en reposo y que fluye mezclas de coloide y polímeros

Resumen

La microscopía confocal se utiliza para obtener imágenes de las mezclas de coloides poliméricos en reposo y que fluyen, los cuales son estudiados como sistemas modelo para suspensiones atractivos. Algoritmos de análisis de imagen se utilizan para calcular las métricas estructurales y dinámicas para las partículas coloidales que miden cambios debido al confinamiento geométrico.

Resumen

El comportamiento de las suspensiones coloidales confinados con atractivas interacciones entre partículas es crítica para el diseño racional de los materiales para el montaje dirigido ^1-3, la administración de fármacos ^4, la mejora de la recuperación de hidrocarburos ^5-7, y los electrodos capaces de fluir para el almacenamiento de energía ^8. Suspensiones que contienen coloides fluorescentes y polímeros no adsorbentes son atractivos sistemas modelo, como la relación entre el radio de giro del polímero a la radio de la partícula y la concentración de polímero de control de la gama y la fuerza de la atracción entre partículas, respectivamente. Al ajustar las propiedades del polímero y la fracción de volumen de los coloides, fluidos coloidales, fluidos de agrupaciones, geles, cristales, y los vidrios se pueden obtener ^9. La microscopía confocal, una variante de la microscopía de fluorescencia, permite una muestra ópticamente transparente y fluorescente para ser reflejado con una alta resolución espacial y temporal en tres dimensiones. En esta técnica, un pequeño orificio o hendidura bloquea la luz fluorescente emitida por regiones de la muestra que se encuentran fuera del volumen focal del sistema óptico del microscopio. Como resultado, se forma la imagen sólo una sección delgada de la muestra en el plano focal. Esta técnica es especialmente adecuado para investigar la estructura y la dinámica en densas suspensiones coloidales en la escala de una sola partícula: las partículas son lo suficientemente grandes como para ser resueltos usando la luz visible y difunden lo suficientemente lento como para ser capturado a velocidades típicas de los sistemas de escaneo confocal comerciales ¹⁰ . Las mejoras en la velocidad de escaneado y algoritmos de análisis han permitido también a la imagen confocal cuantitativa de suspensiones fluidas ^11-16,37. En este trabajo se demuestra experimentos de microscopía confocal para investigar el comportamiento de la fase confinada y las propiedades de flujo de las mezclas de coloides poliméricos. Primero preparamos colloid mezclas de polímeros que son la densidad y el índice de refracción igualados. A continuación, se presenta un protocolo estándar para obtener imágenes densas mezclas de coloides poliméricos reposo bajo diversas confinamiento en celdas en forma de cuña delgada. Por último, demostrar un protocolo para obtener imágenes de las mezclas de coloides poliméricos durante el flujo de microcanales.

Introducción

En este trabajo se demuestra (a) de imagen confocal de mezclas de coloides poliméricos en reposo y que fluyen confinados en dos y tres dimensiones y (b) de las partículas de seguimiento y análisis de correlación de las imágenes resultantes para obtener información cuantitativa sobre el comportamiento de las fases y las propiedades de flujo.

Las suspensiones coloidales con atractivas interacciones entre partículas aparecen por doquier en aplicaciones tecnológicas como materiales para el montaje dirigido ^1-3, la administración de fármacos ^{4, 5-7} mejorada recuperación de hidrocarburos, y el almacenamiento de energía ^8. Una característica común de estas aplicaciones es que las partículas deben ser fluyeron a través de geometrías finas, tales como toberas, cabezales de impresión, microcanales, o medios porosos, y / o ser en forma de películas delgadas o varillas. Las técnicas utilizadas para investigar la estructura de los coloides de tamaño micrométrico en geometrías confinadas, incluyendo microscopía electrónica ^17,18, la microscopía de rayos X ^19, y el láser de difracción microscopy ^20, se puede utilizar para medir la estructura y dinámica de las partículas en la microescala. Estas técnicas, sin embargo, no permiten el acceso a las trayectorias de las partículas individuales, de las cuales las métricas estructurales y dinámicos se pueden calcular para una comparación directa con las simulaciones numéricas ^21,22.

La microscopía confocal es una variante de microscopía de fluorescencia que permite formación de imágenes de secciones delgadas de una muestra fluorescente. Para la ciencia coloidal ^10, esta técnica es particularmente útil para obtener imágenes de las profundidades de suspensiones densas o en tres dimensiones. Algoritmos de partículas de seguimiento de ²³ aplicado a dos series de tiempo-o tridimensional de micrografías confocales producir las trayectorias de todas las partículas visibles. Como resultado, la combinación de la microscopía confocal y de partículas de seguimiento se ha aplicado para estudiar el comportamiento de fase, la estructura y la dinámica de suspensiones coloidales, incluyendo cristales ordenados ^24-27 y trastornoed gafas ^28-31 y ^32-35 geles.

Otros algoritmos de análisis de imagen se pueden aplicar para medir la dinámica de las partículas de la serie de tiempo de micrografías confocales. Por ejemplo, la dinámica de partículas difusoras pueden ser estudiadas mediante el análisis de las fluctuaciones en la intensidad en el tiempo utilizando diferencial microscopía confocal dinámico ^36. Cuando los desplazamientos de las partículas son más grandes que el espaciamiento entre partículas, de correlación de imágenes ³⁷ sobre la base de partícula de imagen velocimetría ^38-40 se puede aplicar para medir perfiles de velocidad de las partículas. La combinación de algoritmos de seguimiento y de correlación ha permitido la dinámica coloidales que se miden en los sistemas sometidos a lento y rápido flujo ^11-16,41-45.

Utilizamos mezclas de coloides poliméricos como modelos para suspensiones coloidales atractivos ^9. En estas mezclas, el rango y la fuerza del atractivo potencial entre partículas se controlan a través de la relacióndel radio de giro del polímero a la radio de la partícula y la concentración del polímero y la repulsión electrostática se controla mediante la adición de una sal orgánica monovalente ^46. Debido a que las interacciones entre partículas se pueden sintonizar cuidadosamente, la solidificación de estas mezclas se ha estudiado ampliamente con microscopía confocal ^34,47-51.

Aquí se demuestra la imagen confocal y análisis de imágenes de ³⁷ mezclas de coloides poliméricos reposo y fluidas, en el que se celebra la fracción de volumen de coloide fija en Φ = 0,15, que la sonda el efecto de confinamiento en el comportamiento de las fases y propiedades de flujo de estas mezclas. Estas técnicas son ampliamente aplicables a los sistemas de partículas que son índice de refracción-emparejados y en el que las partículas y / o disolvente puede ser marcado con un colorante fluorescente.

Protocolo

1. Preparación de mezclas de coloide y polímeros

Nota: Este protocolo utiliza poli (metacrilato de metilo) (PMMA) partículas, estéricamente estabilizado usando poli (ácido 12-hidroxiesteárico) y marcado con un colorante fluorescente (tales como Rojo Nilo, rodamina B, o fluoresceína), que se sintetizó siguiendo una norma receta ^52.

1. Preparar un 3:01 w / w mezcla de bromuro de ciclohexilo (CXB) y decahidronaftaleno (DHN) como una acción disolvente. Esta mezcla casi coincide con la densidad y el índice de refracción de las partículas. Añadir una sal orgánica, cloruro de tetrabutilamonio (TBAC) ^46, al disolvente a una concentración de 1,5 mM a la pantalla parcialmente las cargas de las partículas.
2. Para determinar con precisión la densidad de las partículas, preparar una suspensión en la fracción de volumen de partículas aproximada Φ = 0,10 en el CXB: disolvente DHN. Se centrifuga la suspensión a 800 g durante 75 min y añadir CXB o DHN gota a gota a mejorar la flotabilidadcoincidente. En estos experimentos, se midió la densidad de las partículas de PMMA a ser ρ = 1,223 g / ml.
3. Preparar una suspensión concentrada balance de partículas de PMMA (en este caso, Φ = 0,40) en el CXB: mezcla de disolventes DHN.
4. Preparar una solución concentrada de poliestireno lineal (PS) en el CXB: mezcla de disolventes DHN. Aquí, una solución de PS de peso molecular $ $ _w ≈ 3.000.000 (radio de giro R _G = 15 nm) se prepara a una concentración de C _p ≈ 50 mg / ml.
5. Mezclar pesos apropiados de la partícula, de polímero, y mezclas de disolventes de archivo para formular suspensiones a las concentraciones deseadas de las partículas y polímeros.
   Nota: Aquí, las suspensiones de partículas monodispersas se preparan en la fracción de volumen de coloide constante Φ = 0,15 y la concentración de polímero variable en el volumen libre ⁵³ c _p = 0-25 mg / ml, y bidispersed suspensiones que contienen dos tamaños de partículas coloidales, With cada tamaño que lleven una etiqueta fluorescente distinta, se preparan en la fracción del volumen total de coloide fija Φ = 0,15, relación volumen fracción de pequeñas partículas r = 0,50, y la concentración de polímero en el volumen libre de 5 o 25 mg / ml.
6. Después se prepara cada suspensión, añadir gota a gota CXB o DHN y centrifugar las muestras a 800 xg durante al menos 75 minutos para confirmar que las partículas y grupos dentro de la suspensión permanecen flotabilidad emparejado.
7. Equilibrar todas las muestras durante al menos 24 horas antes de los experimentos de formación de imágenes.

. 2 Experimentos Ejemplos de reposo: el comportamiento de fase

1. Para determinar el comportamiento de la fase a granel, fabricar cámaras rectangulares de cubreobjetos de vidrio (Figura 1a). Para las mezclas de coloide de polímero en este estudio, las cámaras de espesor h = 1 mm (fijado por el grosor de un portaobjetos de microscopio) dan mayor comportamiento.
2. Para tener acceso a múltiples confinamientos en un solo experimento de microscopía, fabricar cuña delgadaen forma de cámaras, utilizando un único cubreobjetos como un espaciador en una cuña (Figura 1b). El ángulo de apertura de la cámara es <0,5 °, de modo que en un solo campo de visión Las paredes son muy casi paralelos. Una cámara de representante permite el acceso a los espesores de confinamiento de h = 6 a> 100 micras.
3. Construir cámaras en una base de cubreobjetos para formación de imágenes en un microscopio invertido y sellar con epoxi curable por radiación UV, que no se disuelve en la mezcla disolvente CXB-DHN.
4. Muestras de imágenes utilizando un microscopio confocal. Este protocolo demuestra imágenes con un confocal de exploración lineal unido a un microscopio invertido equipado con un lente de inmersión en aceite de 100X de apertura numérica NA = 1,40.
5. Excitar los tintes usando una fuente de láser. Aquí longitudes de onda λ = 491 o 561 nm se utilizan para excitar la fluoresceína y colorantes rodamina / Rojo Nilo, respectivamente.
6. En el sistema de puntos de exploración, generar una imagen escaneando rápidamente el punto focal a través de la muestra (en el x-Y plano) usando el software confocal. Una imagen de dos dimensiones de 512 píxeles x 512 píxeles, que cubren aproximadamente 50 micras x 50 micras, pueden ser adquiridos en 1/32 seg. Mejorar la calidad de la imagen al promediar varias imágenes o aumentar el tiempo de adquisición.
7. Ubicar la parte inferior de la cámara (z = 0), por ejemplo, centrándose en partículas adheridas a su parte inferior. En esta configuración, la altura (z) se incrementa con el aumento de enfoque en la cámara.
8. A modo de ejemplo, caracterizar el efecto de confinamiento en la dinámica de las partículas mediante la adquisición de una serie de tiempo de 2-D de imágenes (en el plano xy) en el plano medio de la cámara. En un experimento típico, 500 imágenes de dimensión 512 píxeles x 512 píxeles se adquieren a una velocidad de 1 fotograma / segundo (tiempo espaciado Dt = 1 seg).
9. Como un segundo ejemplo, caracterizar la estructura 3-D de las partículas mediante la adquisición de una serie tridimensional de imágenes (x, y, z). En un experimento típico, imágenes en dos dimensiones (512 píxeles x 512 píxeles) sonadquirida en múltiples posiciones z dentro de la cámara, con una separación constante de Delta Z = 0,2 m entre imágenes consecutivas establecidos por un piezoeléctrico. Una pila volumen que cubre un espesor de h = 30 micras contiene por lo tanto 151 imágenes.
10. Busque y partículas de pista en el tiempo en 2-D o 3-D utilizando el software de partículas de seguimiento escrito en IDL ^23,54-56, MATLAB ^57,58, LabView ^59, o Python ^60. Estos algoritmos permiten típicamente los centros de las partículas que deben resolverse dentro de 40 a 50 nm. Rastreo de partículas exitosa requiere que las partículas se mueven menor que la separación entre partículas entre tramas consecutivas.
11. Desde las posiciones de las partículas, calcular métricas estructurales y dinámicas. Tres parámetros convenientes que se muestran aquí son la función de correlación par 3-D g (r) ^61, el desplazamiento cuadrático medio 2-D (MSD) ^58,62, y el ser parte 2-D de la función de correlación van Hove T _s ( x, t) ⁵⁸. Las dos últimas métricas pueden ser también calculados en 3-D.

. 3 experimentos que fluye: propiedades de flujo

1. Fabrique una celda de flujo simple usando un microcapilar de cristal con sección transversal cuadrada (100 m x 100 m) que está fijada a un tubo de teflón. Utilice cubreobjetos de vidrio para soportar el capilar y proporcionar rigidez mecánica, como se muestra en el esquema de la Figura 7.
2. Cargar la mezcla coloidal-polímero en una jeringa de vidrio. Conecte la jeringa a una bomba de jeringa o un sistema de distribución de fluido neumático.
3. Monte la configuración celda de flujo en el microscopio invertido. Mantener la jeringa, de células, y la salida de flujo a la misma altura para minimizar el efecto de la gravedad sobre el perfil del flujo.
4. Control de la velocidad de flujo de la suspensión a través de la celda de flujo por la tasa de flujo volumétrico (para la bomba de jeringa) o la presión aplicada (para la caja de presión). La velocidad media de la suspensión en los microcanales también depende del doformulación spension. Los valores típicos de la velocidad máxima en los microcanales cuadrados medidos aquí son 200-2.000 m / seg.
5. Durante el flujo, adquirir una serie de 2-D tiempo confocal a velocidades de cuadro rápidas. Aquí, 500 imágenes de dimensión 512 pixeles x 512 pixeles se adquieren a 32 cuadros / seg (tiempo de espaciamiento Δ t = 1/32 seg) a diferentes alturas por encima de la parte inferior de la microcanal (z = 0 micras) que van desde z = 5 - 50 micras. Cada imagen cubre aproximadamente la mitad de la dimensión lateral (y) del microcanal, tal como se muestra en el recuadro a la Figura 7. Si las partículas aparecen elíptica, aumentar la velocidad de fotogramas de adquisición.
6. Al igual que en los experimentos de reposo, localice las partículas en 2-D utilizando algoritmos estándar para la localización y seguimiento de partículas en IDL o Matlab. Para flujos lentos, en el que las partículas se mueven a menos de la distancia media entre partículas entre cuadros, utilizan algoritmos de rastreo para obtener las trayectorias.
7. Utilice correlación de imágenes de calcmular los perfiles de velocidad de los flujos rápidos.
   1. Subdivide la imagen en imágenes horizontales de altura constante (y) a lo largo de la dirección de flujo (x). Para dos imágenes secuenciales I ₁ (x, y) y ₂ (x, y) desplazar la última imagen por un factor de Dx y luego calcular la covarianza cruzada entre I ₁ (x, y) y ₂ (x + Ax, y).
   2. Identificar la posición del pico del histograma de valores Dx que maximizan la covarianza cruzada entre cada par de imágenes para obtener la velocidad de advección media en cada posición y lateral. Si esta distribución no está fuertemente alcanzó su punto máximo, adquirir imágenes a una velocidad más rápida.

Resultados

Para demostrar la imagen confocal y de partículas de seguimiento, se investigó el efecto de confinamiento en el comportamiento de las fases de las mezclas de coloides poliméricos ^63-65. Para estos experimentos el diámetro coloide era 2 a = 0,865 m. La fracción de volumen de coloide se fijó en Φ = 0,15 y la concentración de polímero C _p se varió desde 0 hasta 23,6 mg / ml. Confocal de imágenes representativas se muestran en la Figura 2 ^63, col...

Discusión

Las suspensiones coloidales son ampliamente estudiados como modelos para el comportamiento de fase reducido, ya que las partículas coloidales de tamaño micrométrico exhiben dinámica significativamente más lento que los átomos y las moléculas y por lo tanto se pueden obtener imágenes y seguimiento en el tiempo ¹⁰ fácilmente. Para estos estudios fundamentales, la comprensión del efecto de las atracciones entre partículas en el comportamiento de la fase confinada ofrece la oportunidad de explorar fen?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyclohexyl bromide	Sigma Aldrich	135194	CAS Number  108-85-0, Molecular wt. = 163.06, Used in stock solvent
Decahydronapthalene	Sigma Aldrich	D251	CAS Number 91-17-8, Molecular wt. = 138.25, Used in stock solvent
Nile Red	Sigma Aldrich	72485	Fluorescent dye
Fluorescein 5(6)-isothiocyanate	Sigma Aldrich	F3651	Fluorescent dye
Rhodamine B	Sigma Aldrich	83689	Fluorescent dye
Dynamic Light Scattering	Brookhaven Instruments	BI-APD	DLS equipment used for particle size measurement
Polystyrene	Varian/Agilent	PL20138-23	Polystyrene (polymer) for inducing depletion attraction
Tetrabutyl(ammonium chloride) (TBAC)	Sigma Aldrich	86870	monovalent salt
UV Adhesive	Norland Adhesive	NOA 68T	Part Number 68T01 (UV cured adhesive)
VT Eye	Visitech	VT Eye	confocal scanner
VT Infinity	Visitech	VT Infinity	confocal scanner
Microscope	Leica	DMI3000B	Inverted Microscope
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall ST 16	1-5,000 rpm
Teflon tubing	smallparts	SLTT 26-72	Zeus PTFE Sublite Wall Tubing 26 AWG 0.016" ID x 0.003" Wall
Epoxy	Devcon	DA051	5 min epoxy
Syringe	Micromate/Cadence	5004	glass syringe with metal luer lock tip
Syringe tips	Nordson	7018462	32 GA precision tips
Syringe pump	New Era Pump system Inc.	NE1002X	Programmable microfluidic pump (syringepump.com)
Weigh balance	Mettler Toledo	AB204-S	0.0001-220 g
PMMA particles	synthesized		poly(methylmethacrylate) colloidal particles