밀폐 무부하 흐르는 콜로이드 중합체 혼합물의 공 촛점 이미징

요약

공 초점 현미경은 매력적인 현탁액을위한 모델 시스템으로 공부하는 이미지 정지 흐르는 콜로이드 폴리머의 혼합물에 사용된다. 이미지 분석 알고리즘은 기하 구속에 의한 변화를 측정 콜로이드 입자의 구조 및 동적 메트릭을 계산하는 데 사용된다.

초록

매력적인 입자 간 상호 작용이 제한 콜로이드 현탁액의 동작은 직접 조립 ^1-3, 약물 전달 ⁴ 재료의 합리적인 디자인, 개선 된 탄화수소 복구 ^5-7, 에너지 저장 ⁸ 유동성 전극에 중요합니다. 형광 콜로이드 및 비 흡착 중합체를 함유하는 현탁액은 범위와 입자 간 장르의 강도, 각각 중합체 컨트롤의 입자 반경 농도 관성 중합체 반경의 비로서, 모델 시스템을 호소하고있다. 중합체 특성 및 콜로이드의 체적 분율을 튜닝함으로써, 콜로이드 유체가 클러스터의 유체, 겔, 결정 및 유리 ^구를 얻을 수있다. 공 초점 현미경, 형광 ​​현미경의 변형은, 광학적으로 투명한 형광 샘플이 묘화 될 수있게 높은 공간 및 세 가지 차원의 시간 해상도를 가진. 이 기술, 작은 핀홀이나에서 현미경 광학계의 초점 체적 벗어나는 시료의 영역에서 블록들 출사 형광 슬릿. 결과적으로, 초점 평면에서의 샘플 만 얇은 부분이 묘화된다. 이 기술은 특히 단일 입자의 규모 밀도 콜로이드 현탁액의 구조와 역학을 조사하는 데 적합합니다 : 입자는 가시 광선을 사용하여 해결 될 수있을만큼 큰 상업 공 초점 시스템 ^(10)의 전형적인 스캔 속도로 캡처 할 정도로 천천히 확산 . 스캔 속도 및 분석 알고리즘의 개선은 흐르는 현탁액 ^11-16,37의 양적 공 촛점 이미징을 사용할 수있다.이 논문에서, 우리는 좁은 상 거동 및 콜로이드 고분자 혼합물의 유동 특성을 조사하는 공 초점 현미경 실험을 보여줍니다. 우리는 먼저 콜을 준비밀도와 굴절율이다 OID 중합체 혼합물 일치. 다음으로, 우리는 얇은 쐐기 모양의 세포에 변화 감금에서 대기 밀도 콜로이드 고분자 혼합물 이미징을위한 표준 프로토콜을보고합니다. 마지막으로, 우리는 마이크로 유동 중에 콜로이드 중합체 혼합물을 이미징하는 프로토콜을 설명한다.

서문

이 논문은 대기 흐르는 국한 콜로이드 고분자 두의 혼합물 및 세 가지 차원와 (b) 입자 추적 및 상관 관계 상 거동 및 유동 특성에 대한 정량적 인 정보를 얻기 위해 생성 된 이미지의 분석 () 공 초점 영상을 보여줍니다.

매력적인 입자 간 상호 작용 콜로이드 현탁액은 직접 조립 ^1-3, 약물 전달 ^4, 개선 된 탄화수소 복구 ^5-7, 에너지 저장 ⁸ 재료로 기술 응용 프로그램에서 보편적으로 나타납니다. 이러한 응용 프로그램의 일반적인 특징은 입자는 노즐, 프린트 헤드, 마이크로, 또는 다공질 미세한 형상을 통해 유입되어야하며, 및 / 또는 얇은 필름 또는 봉으로 형성 될 것입니다. 전자 현미경 ^{(17, 18),} x-레이 현미경 ^(19), 및 레이저 회절 m 등 좁은 형상, 미크론 크기의 콜로이드의 구조를 조사하는 데 사용되는 기술²⁰ icroscopy, 마이크로 스케일의 입자의 구조와 역학을 측정하는데 사용될 수있다. 이러한 기술은, 그러나, 구조 및 동적 메트릭 수치 시뮬레이션 ^21,22 직항 비교를 위해 계산 될 수있는 개별 입자의 궤적에 대한 액세스를 허용하지 않는다.

공 초점 현미경 형광 샘플의 얇은 부분의 영상을 가능하게 형광 현미경의 변종이다. 콜로이드 과학 ^(10)의 경우,이 기술은 깊은 밀도 현탁액 내에서 또는 세 가지 차원으로 이미징에 특히 유용합니다. 입자 추적 알고리즘 ^(23)는 보이는 모든 입자의 궤적을 수득 둘 또는 공 초점 현미경의 입체 시계열에 적용. 결과적으로, 공 초점 현미경 및 입자 추적의 조합 순서 결정 ^24-27 및 장애를 포함하여, 상 거동, 구조 및 콜로이드 현탁액의 동역학을 연구하기 위해 적용된ED는 ^{28 ~ 31,} 젤 ^{32-35 안경.}

기타 이미지 분석 알고리즘은 공 초점 현미경의 시계열로부터 입자 동역학을 측정하기 위해 적용될 수있다. 예를 들어, 확산 입자 역학 공 초점 차 동적 현미경 ^(36)를 사용하여 시간이 지남에 따라 강도의 변동을 분석하여 공부하실 수 있습니다. 입자 변위는 입자 간 간격보다 큰 경우, 입자 화상 유속계 ^38-40에 근거 화상 상관 관계 ^(37)는 입자의 속도 프로파일을 측정하기 위해 적용될 수있다. 추적 및 상관 관계 알고리즘의 조합은 콜로이드 역학 느리고 빠른 흐름 ^{11-16,41-45을받은} 시스템에서 측정 할 수있다.

우리는 매력적인 콜로이드 현탁액 ⁹ 모델로 콜로이드 폴리머의 혼합물을 사용합니다. 이러한 혼합물에서, 매력적인 입자 간 전위의 범위 및 강도 비율을 통해 제어된다입자 반경 및 중합체 및 정전 반발력 농도 관성 중합체 반경 가의 유기 염 ^(46)의 첨가를 통해 제어된다. 입자 간 상호 작용이 깊게 튜닝 될 수 있으므로, 이들의 혼합물의 고화는 광범위 ^34,47-51 공 촛점 현미경으로 연구되었다.

여기서 우리는 콜로이드 체적 분율이 Φ 고정 개최되는, 대기 흐르는 콜로이드 고분자 혼합물의 공 촛점 이미징 및 이미지 분석 ^(37)를 보여 = 0.15, 그 프로브 상 거동 및 이들의 혼합물의 유동 특성에 대한 제한의 효과. 이러한 기술은 굴절되어 입자상 시스템에 광범위하게 적용될 수있다 지수 일치하고있는 입자 및 / 또는 용매를 형광 염료로 표지 할 수있다.

프로토콜

콜로이드 중합체 혼합물의 하나. 제조

주 :이 프로토콜은 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 입자, 입체적 폴리 (12 - 하이드 록시 산)를 사용하여 안정화 및 표준 다음 합성 하였다 (예 나일 레드, 로다 민 B, 또는 플루오 레세 인 등) 형광 염료로 표지를 사용 조리법 ^52.

1. 주식 용매로 헥실 브로마이드 (CXB)과 데카 (DHN)의 3:1 W / W 혼합물을 준비합니다. 이 혼합물은 거의 입자의 굴절의 밀도 및 인덱스와 일치합니다. 부분적으로 입자에 전하를 화면에 1.5 mm의 농도로 용매에 유기 염, 테트라 부틸 암모늄 클로라이드 (TBAC) ^46을 추가합니다.
2. DHN 용매 : 정확하게 입자의 밀도를 확인하려면 대략 입자의 부피 분율 Φ에서 서스펜션 = CXB 0.10를 준비합니다. 75 분 800 XG에 현탁액을 원심 분리기 및 부력을 향상시키기 위해 CXB 또는 DHN의 적하 추가일치. 이들 실험에서, PMMA 입자의 밀도 = 1.223 g / ㎖ ρ 될 측정 하였다.
3. DHN 혼합 용매 : CXB의 PMMA 입자의 집중 주식 서스펜션 (여기서, Φ = 0.40) 준비합니다.
4. DHN 혼합 용매 : CXB 선형 폴리스티렌 (PS)의 농축 된 용액을 준비합니다. 여기에, 3,000,000가 (선회 R _G = 15 ㎚의 반경) 50 ㎎ / ㎖ ≈ 농도 C의 _P에서 준비 ≈ _W 분자량 M의 PS의 솔루션을 제공합니다.
5. 입자와 고분자의 원하는 농도로 현탁액을 공식화하는 입자, 폴리머, 용제 주식 혼합물의 가중치를 적절하게 혼합한다.
   참고 : 여기에, 단 분산 입자의 현탁액은 일정 콜로이드 체적 분율 Φ에서 준비 = 무료 볼륨 ⁵³ C의 _P 0.15 변수 중합체 농도 = 0 ~ 25 ㎎ / ㎖ 및 W, 콜로이드 입자의 두 가지 크기를 포함하는 현탁액을 bidispersed독특한 형광 라벨 담지 i 번째의 각 크기는 고정 된 전체 콜로이드 부피비 Φ로 제조된다 = 소립자 0.15, 체적 분율의 비율은 5 ~ 25 ㎎ / ㎖의 자유 부피 = 0.50 R 및 중합체 농도.
6. 각 현탁액을 제조 한 후, 현탁액 내의 입자 클러스터 부력 일치 남아 있는지 확인하기 위해 최소 75 분 800 XG에 CXB 또는 DHN 적하 원심 분리기 샘플을 추가합니다.
7. 이전의 영상 실험에 최소 24 시간 동안 모든 샘플을 평형.

. 2 대기 샘플 실험 : 위상 동작

1. 벌크 상 거동을 결정하기 위해, 유리 커버 슬립 (그림 1a)에서 직사각형 챔버를 제작. 이 연구에서 콜로이드 고분자 혼합물의 경우, (현미경 슬라이드의 두께에 의해 설정) 두께 H = 1 ㎜의 챔버 대량 동작을 제공합니다.
2. 하나의 현미경 실험에서 여러 confinements에 액세스하려면, 얇은 쐐기 - 제작하나의 웨지에 스페이서로서 단일 커버 슬립을 사용하여 실 모양 (도 1B). 뷰의 단일 필드에서 벽은 매우 거의 평행이되도​​록 챔버의 개방 각도는 <0.5 °이다. 대표적인 챔버> 100 μm의 = 6 시간의 구속 두께에 액세스 할 수 있습니다.
3. 거꾸로 현미경에 이미징을위한 커버 슬립베이스에 실을 구축하고 CXB-DHN 혼합 용매에 용해되지 않는 UV 경화형 에폭시로 밀봉.
4. 공 초점 현미경을 사용하여 이미지 샘플. 이 프로토콜은 NA가 1.40 = 개구의 100X 기름 침지 렌즈가 장착 된 거꾸로 현미경에 부착 된 라인 스캐닝 공 촛점과 영상을 보여줍니다.
5. 레이저 소스를 사용하여 염료를 여기. 여기에서 λ = 491 또는 561 nm의 각각의 형광 및 로다 민 / 나일 레드 염료를 자극하는 데 사용되는 파장을.
6. 포인트 - 스캔 시스템에서 급속에서 (샘플에 걸쳐 초점을 스캐닝 x-의해 화상을 생성공 초점 소프트웨어를 사용하여 Y 평면). 512 픽셀의 2 차원 이미지가 1 / 32 초에서 획득 할 수있는 약 50 ㎛ × 50 ㎛의를 덮고 512 픽셀, 배. 여러 이미지들을 평균하거나 획득 시간을 증가시킴으로써 화질을 향상시킨다.
7. 챔버의 바닥을 찾습니다 (Z = 0), 그 아래에 부착 된 입자에 초점을 맞춤으로써, 예를 들어. 이 설정에서, 높이 (z)는 챔버 내로 포커스 증가와 함께 증가한다.
8. 예로서, 챔버의 미드 플레인에서 (XY 평면) 화상의 2-D의 시계열을 취득함으로써 입자의 역학에 구속 효과를 특성화. 전형적인 실험에서, 치수 500 이미지가 X 512 픽셀 512 픽셀이 1 프레임 / 초의 프레임 속도 (시간의 Δt = 1 초 간격)에 인수된다.
9. 두 번째 예로서, 화상의 입체 시리즈 (x, y, z)를 취득하여 입자의 3-D 구조를 특성화. 전형적인 실험에서, 이차원 이미지 (512 화소 × 512 화소)이다ΔZ의 일정한 간격 = 압전 설정 연속 된 이미지 사이에 0.2 μm의와, 챔버 내에서 여러 Z 위치에 인수했다. H의 두께를 포함하는 볼륨 스택 = 30 μm의, 따라서 151 이미지가 포함되어 있습니다.
10. 찾기 및 2-D 또는 3-D에서 시간이 지남에 따라 추적 입자 IDL ^23,54-56, MATLAB ^{57, 58,} LabVIEW는 ^59, 파이썬 ^(60)로 작성 입자 추적 소프트웨어를 사용하여. 이러한 알고리즘은 일반적으로 입자의 중심이 40 ~ 50 나노 미터 내에 해결 될 수있다. 성공적인 입자 추적 입자가 연속 된 프레임 사이의 입자 간 간격보다 이동하는 것이 필요합니다.
11. 입자의 위치에서, 구조 및 동적 통계를 계산합니다. 여기에 도시 된 세 가지 편리한 메트릭 (3-D 쌍 상관 함수 g (R) ^(61), 2-D, 평균 제곱 변위 (MSD) ^58,62, 및 반 호브 상관 함수 G _(S)의 2-D자가 일부인 x, t) ⁵⁸. 후자의 두 메트릭은 또한 3-D로 계산 될 수있다.

. 3 흐르는 실험 : 유동 특성

1. 테프론 튜브에 부착되어 사각형 단면 (100 μM × 100 μM)와 유리 마이크로 모세관을 사용하여 간단한 플로우 셀을 제조. 도 7에 개략적으로 도시 된 바와 같이, 모세관을 지원 및 기계적 강성을 제공하기 위해 유리 커버 슬립을 사용한다.
2. 유리 주사기에 콜로이드 폴리머의 혼합물을로드합니다. 주사기 펌프 또는 공기 유체 분배 시스템에 주사기를 연결합니다.
3. 거꾸로 현미경에 흐름 전지 설치를 탑재합니다. 유량 프로파일에 중력의 영향을 최소화하기 위해 동일한 높이로 셀 및 유출 흐름 주사기 유지.
4. (시린지 펌프) 체적 유량 또는 (압력 상자)인가 압력에 의해 유동 셀을 통해 현탁액의 유량을 제어한다. 마이크로 채널에있는 현탁액의 평균 속도는 SU에 의존spension 제제. 여기에서 측정 된 사각형 마이크​​로의 최대 속도의 일반적인 값은 200-2,000 μm의 / 초이다.
5. 흐름 동안, 빠른 프레임 속도에서 2-D 촛점 시계열을 획득. 여기서 차원의 500 이미지가 X 512 픽셀 512 픽셀 Z에서 = 5에 이르기까지 마이크로의 바닥 (Z = 0 μm의) 위의 서로 다른 높이에 (시간 간격 Δ의 T = 1 / 32 초) 32 프레임 / 초에 취득 - 50 ㎛. 7 그림 삽입과 같이 각각의 이미지는, 마이크로의 측면 치수 (Y)의 약 절반을 커버한다. 입자가 타원 나타날 경우 인수의 프레임 속도를 향상시킬 수 있습니다.
6. 대기 실험에서와 같이, IDL 또는 MATLAB에서 입자의 위치 및 추적에 대한 표준 알고리즘을 사용하여 2-D의 입자를 찾습니다. 입자는, 프레임 사이의 평균 입자 간 거리보다 적게 이동 궤적을 구하는 추적 알고리즘을 사용하는 느린 흐름하십시오.
7. CALC 이미지의 상관 관계를 사용하여ulate 빠른 흐름의 속도 프로파일.
   1. 흐름의 방향을 따라 일정한 높이 (Y)의 수평 이미지로 이미지를 세분 (X). 두 순차 이미지 I ₁ (X, Y) 및 I ₂ (X, Y)에 대한 계수 ΔX에 의해 후자의 이미지를 이동하고 나서 ₁ (X, Y) 사이의 교차 공분산을 계산하고 I ₂ (X + ΔX, Y).
   2. 각각의 횡 방향 위치 (y)에서의 평균 이류 속도를 얻기 위해 이미지의 각 쌍 사이의 크로스 공분산을 최대화 ΔX 값들의 히스토그램의 피크 위치를 식별한다. 이러한 분포가 강하게 뾰족하지 않은 경우 빠른 프레임 레이트로 영상을 획득.

결과

공 촛점 이미징 및 입자 추적을 설명하기 위해, 우리는 콜로이드 폴리머의 혼합물을 ^{63 ~ 65의} 상 거동에 대한 제한의 효과를 조사 하였다. 이 실험을 위해 콜로이드 직경 2 = 0.865 ㎛,. 콜로이드 부피 분율은 Φ = 0.15로 고정시키고 중합체 C _(P)의 농도는 0 내지 23.6 ㎎ / ㎖로 변화시켰다. 대표 공 촛점 이미지는 그림 2 ^(63), 왼쪽 열에 표시됩니다. 추적 알고리?...

토론

마이크론 크기의 콜로이드 입자는 원자와 분자보다 훨씬 느린 역학을 전시하기 때문에 쉽게 몇 군데 시간 ¹⁰ 이상 추적 할 수 있기 때문에 콜로이드 현탁액은 널리 국한 상 거동에 대한 모델로 연구한다. 이러한 기초 연구의 경우, 밀폐 된 단계 행동에 입자 간 관광 명소의 효과를 이해하는 것은 모세관 응축 및 증발 ^21,22,67 등의 현상을 탐구 할 수있는 기회를 제공합니다. 또한, 밀?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyclohexyl bromide	Sigma Aldrich	135194	CAS Number  108-85-0, Molecular wt. = 163.06, Used in stock solvent
Decahydronapthalene	Sigma Aldrich	D251	CAS Number 91-17-8, Molecular wt. = 138.25, Used in stock solvent
Nile Red	Sigma Aldrich	72485	Fluorescent dye
Fluorescein 5(6)-isothiocyanate	Sigma Aldrich	F3651	Fluorescent dye
Rhodamine B	Sigma Aldrich	83689	Fluorescent dye
Dynamic Light Scattering	Brookhaven Instruments	BI-APD	DLS equipment used for particle size measurement
Polystyrene	Varian/Agilent	PL20138-23	Polystyrene (polymer) for inducing depletion attraction
Tetrabutyl(ammonium chloride) (TBAC)	Sigma Aldrich	86870	monovalent salt
UV Adhesive	Norland Adhesive	NOA 68T	Part Number 68T01 (UV cured adhesive)
VT Eye	Visitech	VT Eye	confocal scanner
VT Infinity	Visitech	VT Infinity	confocal scanner
Microscope	Leica	DMI3000B	Inverted Microscope
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall ST 16	1-5,000 rpm
Teflon tubing	smallparts	SLTT 26-72	Zeus PTFE Sublite Wall Tubing 26 AWG 0.016" ID x 0.003" Wall
Epoxy	Devcon	DA051	5 min epoxy
Syringe	Micromate/Cadence	5004	glass syringe with metal luer lock tip
Syringe tips	Nordson	7018462	32 GA precision tips
Syringe pump	New Era Pump system Inc.	NE1002X	Programmable microfluidic pump (syringepump.com)
Weigh balance	Mettler Toledo	AB204-S	0.0001-220 g
PMMA particles	synthesized		poly(methylmethacrylate) colloidal particles