監禁静止と流れるコロイド·ポリマー混合物の共焦点イメージング

要約

共焦点顕微鏡は、魅力的な懸濁液のためのモデル系として研究されている画像の静止や流れるコロイドポリマー混合物に使用されます。画像解析アルゴリズムは、幾何学的な閉じ込めに起因する変化を測定するコロイド粒子のための構造的および動的メトリックを計算するために使用される。

要約

魅力的な粒子間相互作用を有する閉じ込められたコロイド懸濁液の挙動は監督アセンブリ^1-3、薬物送達の⁴のための材料の合理的な設計、改善された炭化水素の回復^5-7、およびエネルギー貯蔵⁸ための流動性の電極に不可欠です。蛍光コロイドおよび非吸着性ポリマーを含有する懸濁液は、それぞれ、ポリマー制御の粒子半径と濃度に旋回の高分子半径の比粒子間引力の範囲や強度など、モデル系を訴えている。ポリマー特性及びコロイドの体積分率を調整することによって、コロイド流体は、クラスタの流体、ゲル、結晶、およびガラスが⁰⁹を得ることができる。 共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡の変異体は、光学的に透明で蛍光試料が画像化されることを可能にする3次元での高空間分解能と時間分解能を持つ。この技術では、小さなピンホール又は顕微鏡光学系の焦点体積の外側にある試料の領域からブロックを発する蛍光スリット。その結果、焦点面における試料の唯一の薄い部分が画像化される。この技術は、特によく単一粒子スケールで緻密なコロイド懸濁液中の構造および動態を調べるのに適している：粒子は、可視光を使用して解決されるのに十分大きく、商業共焦点システム¹⁰の典型的な走査速度で捕捉される十分にゆっくり拡散する。スキャン速度と解析アルゴリズムの改善にも流れる懸濁液 ^11-16,37 の定量的な共焦点イメージングを可能にした。本稿では、限られた相挙動とコロイド-ポリマー混合物の流動特性を調べるために、共焦点顕微鏡実験を示しています。我々は最初のコルを準備密度及び屈折率であるOIDポリマーの混合物が一致しました。次に、薄いくさび形の細胞内の様々な密封下の静止密なコロイド - ポリマーの混合物を画像化するための標準プロトコルを報告する。最後に、我々はマイクロチャネル流中にコロイドポリマー混合物を撮像するためのプロトコルを示す。

概要

本論文では、2と3次元で静止して流れる閉じ込められたコロイドポリマー混合物（a）の共焦点イメージングを示し、（b）の粒子の追跡と相関関係が相挙動と流動特性に関する定量的情報を得るために、結果として得られる画像の解析。

魅力的な粒子間相互作用を有するコロイド懸濁液を指向アセンブリ^1-3のための材料、薬物送達^4、改良された炭化水素回収^5-7のような技術的応用において遍在的に表示され、エネルギー貯蔵^8。これらのアプリケーションの共通の特徴は、粒子は、ノズル、印字ヘッド、マイクロチャネル、または多孔性媒体の微細な幾何学的形状を流れなければならず、及び/又は薄いフィルムまたはロッドに成形されることである。電子顕微鏡^17,18、X線顕微鏡^19、およびレーザー回折Mを含む限られた幾何学的にミクロンサイズのコロイドの構造を調べるために使用される技術²⁰ icroscopy、マイクロスケールでの粒子の構造および動態を測定するために使用することができる。これらの技術は、しかしながら、構造的および動的なメトリックは、数値シミュレーション^21,22との直接の比較のために計算することができ、そこから個々の粒子の軌跡へのアクセスを許可しない。

共焦点顕微鏡は、蛍光試料の薄い切片のイメージングを可能にする蛍光顕微鏡の変形である。コロイド科学¹⁰については、この技術は、深い緻密懸濁液内または三次元的に画像化するために特に有用である。粒子追跡アルゴリズム^23は、共焦点顕微鏡の2次元または3次元時系列に適用し、すべての可視の粒子の軌道を生じる。結果として、共焦点顕微鏡法および粒子追跡の組合せは、結晶秩序^24-27および障害を含む、相の挙動、構造、およびコロイド懸濁液のダイナミクスを研究するために適用されているEDは^28〜31およびゲル^{32〜35メガネ} 。

他の画像解析アルゴリズムは、共焦点顕微鏡の時系列から粒子のダイナミクスを測定するために適用することができる。例えば、拡散粒子のダイナミクスは、共焦点差動的顕微鏡^36を用いて経時的な強度の変動を分析することにより研究することができる。粒子変位が粒子間の間隔よりも大きい場合には、粒子画像流速^38-40に基づいて、画像相関^37は、粒子の速度分布を測定するために適用することができる。追跡と相関アルゴリズムの組み合わせは、コロイドダイナミクスが遅く、速い流れ^{11-16,41-45を}受けているシステムで測定することができました。

我々は魅力的なコロイド懸濁液⁹のモデルとしてコロイドポリマーの混合物を使用しています。これらの混合物中、魅力的な粒子間ポテンシャルの範囲と強さの比を介して制御される粒子半径とポリマーとの静電反発の濃度のポリマー旋回半径の一価の有機塩⁴⁶の添加を介して制御される。粒子間相互作用が慎重に調整することができるので、これらの混合物の固化が広く^34,47-51共焦点顕微鏡を用いて研究されてきた。

ここでは、これらの混合物の相挙動および流動特性に閉じ込め効果を調べる共焦点イメージングおよび画像解析コロイド体積分率が、Φ= 0.15で固定保持された静止及び流れるコロイドポリマー混合物の^37を 、実証している。これらの技術は、屈折率整合して粒子および/または溶媒を蛍光色素で標識することが可能である微粒子系に広く適用可能である。

プロトコル

1。コロイド - ポリマー混合物の製造に

注意：このプロトコルは、ポリ（メチルメタクリレート）（PMMA）粒子、立体的にポリ（12 - ヒドロキシステアリン酸）を用いて安定化標準に従って合成した（例えば、ナイルレッド、ローダミンB、またはフルオレセインなど）、蛍光色素で標識を使用してレシピ^52。

1. 株式溶媒としてシクロヘキシルブロマイド（CXB）とデカヒドロ（DHN）の3:1 w / wの混合物を準備します。この混合物は、ほぼ粒子の屈折の密度とインデックスと一致します。部分的に、粒子の電荷をスクリーニングする1.5 mMの濃度で溶媒中に、有機塩、テトラブチルアンモニウムクロリド^{（TBAC）46を}追加します。
2. DHN溶媒：正確に粒子の密度を決定するために、おおよその粒子の体積分率Φのサスペンション= CXB 0.10を準備。 75分間800×gで懸濁物を遠心分離し、浮力を向上させるためにCXBまたはDHN滴下するマッチング。これらの実験において、PMMA粒子の密度= 1.223グラム/ mlのρことが測定された。
3. CXB（ここで、Φ= 0.40）PMMA粒子の濃縮ストック懸濁液を準備します。DHN混合溶媒。
4. DHN混合溶媒：CXBの線形ポリスチレン（PS）の濃厚溶液を調製する。ここで3,000,000（回転半径R _G = 15ナノメートル）≈分子量M _wのPSの溶液を、濃度C _pは ≈50ミリグラム/ mlに調製する。
5. 粒子とポリマーの所望の濃度で懸濁物を配合するために、粒子、ポリマー、溶媒株式混合物の適切な重みを混ぜる。
   注：ここでは、単分散粒子の懸濁液は、一定のコロイド体積分率Φで調製する=自由体積^53cと _pにおける0.15および可変ポリマー濃度= 0〜25 mg / mlであり、wは、コロイド粒子2つのサイズを含む懸濁液bidispersed異なる蛍光標識を有するi番目の各サイズは、固定された総コロイド体積分率Φで調製さ=小粒子の0.15、体積分率が5または25 mg / mlの自由体積中= 0.50 rは、ポリマー濃度。
6. 各サスペンションを用意した後、懸濁液中の粒子やクラスターが浮力一致残っていることを確認するために、少なくとも75分間800×gでCXBまたはDHN滴下し、遠心分離器のサンプルを追加します。
7. イメージング実験の前に少なくとも24時間のすべてのサンプルを平衡化させます。

2静止サンプル実験：。相挙動

1. バルク相挙動を決定するために、ガラス製カバースリップ（ 図1a）から長方形のチャンバーを製作。本研究ではコロイド-ポリマー混合物については、（顕微鏡のスライドの厚さによって設定される）、厚さh = 1mmのチャンバーは、バルクの挙動を与える。
2. シングル顕微鏡実験で複数の閉じ込めにアクセスするには、薄いくさびを製作1くさび上のスペーサーとして単一のカバースリップを使用して、チャンバ形状（ 図1b）。単一の視野の壁は非常にほぼ平行になるようにチャンバの開口角が、<0.5°である。代表室は、>100μmのH = 6の閉じ込め厚さへのアクセスを許可します。
3. 倒立顕微鏡でのイメージングのためのカバーガラス基盤上のチャンバーを構築し、CXB-DHN混合溶媒に溶解しないUV硬化性エポキシで密封する。
4. 共焦点顕微鏡を用いた画像サンプル。このプロトコルは、開口数NA = 1.40の100倍油浸レンズを備えた倒立顕微鏡に装着ラインスキャン共焦点とイメージングを示しています。
5. レーザー光源を使用して色素を励起する。ここで、λ= 491または561nmでは、それぞれ、フルオレセインおよびローダミン/ナイルレッド色素を励起するために使用される波長。
6. 点走査システムでは、急速に（x軸に試料を横切って焦点を走査して画像を生成する共焦点ソフトウェアを用いてy平面）。約50ミクロン×50ミクロンを覆う×512ピクセル512ピクセルの二次元画像は、1/32秒で取得することができる。複数の画像を平均化するか、取得時間を増加させることにより画質を向上させる。
7. チャンバーの底の位置を確認します（Z = 0）、その底部に付着したパーティクルに注力するなど。このセットアップでは、高さ（z）はチャンバ内にフォーカスの増加に伴って増加する。
8. 一例として、チャンバの中央平面において（x-y平面における）画像の2-Dの時系列を取得することにより、粒子のダイナミクスに閉じ込め効果を特徴付ける。典型的な実験では、500次元の画像は、512×512ピクセルのピクセルは1フレーム/秒のフレームレート（時間Δt= 1秒間隔）で取得される。
9. 第2の例として、画像の三次元シリーズ（x、y、z）を取得することにより、粒子の3-D構造を特徴付ける。典型的な実験では、2次元画像（512ピクセル×512ピクセル）であるピエゾで設定された連続した画像間の=0.2μmのΔzの一定の間隔で、チャンバ内の複数のz位置で取得しました。 H =30μmの厚さをカバーするボリューム·スタックは、このように151の画像が含まれています。
10. IDL ^{23,54-56、MATLAB 57,58}と、LabVIEW ^59、やPython ⁶⁰で書かれた粒子追跡ソフトウェアを使用して、2次元または3次元に時間をかけて探して、トラック粒子。これらのアルゴリズムは、典型的には、粒子の中心が40〜50ナノメートル以内に解決されることを可能にする。成功した粒子追跡は、粒子が連続するフレーム間の粒子間の間隔よりも少ないを移動する必要があります。
11. パーティクルの位置から、構造的かつダイナミックなメトリックを計算します。ここに示した三つの便利な測定基準は、（3-D対相関関数g（r）は ⁶¹ ,2-Dの平均二乗変位^{（MSD）58,62、}およびファンホーブ相関関数G _sを2-D自己一部であるx、t）が⁵⁸。後者の2つのメトリックはまた、3次元で計算することができる。

3フローイング実験：流動特性

1. テフロンチューブに固定された正方形の断面（100ミクロン×100ミクロン）でガラスマイクロキャピラリーを使用した簡単なフローセルを製作。 図7の概略図に示すように、キャピラリを支持し、機械的剛性を提供するために、カバーガラスを使用する。
2. ガラスシリンジにコロイドポリマー混合物をロードします。シリンジポンプまたは空気圧流体分配システムに注射器を取り付けます。
3. 倒立顕微鏡上にフローセルセットアップをマウントします。流れプロファイルに対する重力の影響を最小限にするために同じ高さで、細胞、および出口を流れる、シリンジを保つ。
4. （シリンジポンプの場合）体積流量又は（圧力ボックス）に加えられる圧力によってフローセルを通して懸濁液の流量を制御する。マイクロチャネル中の懸濁液の平均速度はまた、suの依存spension配合。ここで測定平方マイクロチャネル内の最大速度の典型的な値は200〜2,000程度/秒である。
5. 流れの間、速いフレームレートで2-D共焦点時系列を取得する。ここで、寸法は512ピクセルの500の画像が×512ピクセルは、z = 5に至るまで、マイクロチャネルの底部の上の異なる高さ（Z = 0ミクロン）で32フレーム/秒（時間ΔT = 1/32秒間隔）で取得される- 50μmである。各画像は、挿入図に示すように、粒子は楕円表示された場合、 図7を参照する 、マイクロチャネルの横方向寸法（y）の略半分を覆う、取得フレームレートを増加させる。
6. 静止実験のように、IDL、またはMATLABでの粒子の位置を特定し、追跡するための標準的なアルゴリズムを使用して、2次元での粒子の位置を確認します。粒子は、フレーム間の平均粒子間距離よりも短い移動軌跡を取得するための追跡アルゴリズムを使用する遅い流れ、である。
7. カルクに画像相関を使用しキュレートの高速フローの速度分布。
   1. 流れの方向に沿って一定の高さ（y）の水平方向の画像に画像を分割（x）である。二つの連続画像I _1（x、y）及びI _2（x、y）の係数Δxだけ後者の像をシフトした後、I _1（x、y）及びI _2（x +Δxとの間の相互共分散を計算するためy）とする。
   2. 各横位置yでの平均移流速度を得るために、画像の各対の間の相互共分散を最大化Δxの値のヒストグラムのピーク位置を特定する。この分布が強くピークに達していない場合は、より速いフレームレートで画像を取得する。

結果

共焦点イメージングおよび粒子追跡を実証するために、我々は、コロイドポリマー混合^63-65の相挙動に対する閉じ込めの効果を調べた。これらの実験のためにコロイド直径は2 = 0.865であった。コロイドの体積分率は、Φ= 0.15に固定し、 ポリマー c _pの濃度は、0〜23.6 mg / mlのに変化させた。代表的な共焦点画像は、 図2 ^63、左の列に示されてい?...

ディスカッション

ミクロンサイズのコロイド粒子は、原子や分子よりも有意に遅いダイナミクスを示し、このように容易に画像化し、時間¹⁰的に追跡することができるため、コロイド懸濁液は広く、限られた相挙動のモデルとして研究されている。これらの基本的な研究のために、限られた相挙動に対する粒子間の観光スポットの影響を理解することは、このような毛管凝縮と蒸発^21,22,67など?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyclohexyl bromide	Sigma Aldrich	135194	CAS Number  108-85-0, Molecular wt. = 163.06, Used in stock solvent
Decahydronapthalene	Sigma Aldrich	D251	CAS Number 91-17-8, Molecular wt. = 138.25, Used in stock solvent
Nile Red	Sigma Aldrich	72485	Fluorescent dye
Fluorescein 5(6)-isothiocyanate	Sigma Aldrich	F3651	Fluorescent dye
Rhodamine B	Sigma Aldrich	83689	Fluorescent dye
Dynamic Light Scattering	Brookhaven Instruments	BI-APD	DLS equipment used for particle size measurement
Polystyrene	Varian/Agilent	PL20138-23	Polystyrene (polymer) for inducing depletion attraction
Tetrabutyl(ammonium chloride) (TBAC)	Sigma Aldrich	86870	monovalent salt
UV Adhesive	Norland Adhesive	NOA 68T	Part Number 68T01 (UV cured adhesive)
VT Eye	Visitech	VT Eye	confocal scanner
VT Infinity	Visitech	VT Infinity	confocal scanner
Microscope	Leica	DMI3000B	Inverted Microscope
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall ST 16	1-5,000 rpm
Teflon tubing	smallparts	SLTT 26-72	Zeus PTFE Sublite Wall Tubing 26 AWG 0.016" ID x 0.003" Wall
Epoxy	Devcon	DA051	5 min epoxy
Syringe	Micromate/Cadence	5004	glass syringe with metal luer lock tip
Syringe tips	Nordson	7018462	32 GA precision tips
Syringe pump	New Era Pump system Inc.	NE1002X	Programmable microfluidic pump (syringepump.com)
Weigh balance	Mettler Toledo	AB204-S	0.0001-220 g
PMMA particles	synthesized		poly(methylmethacrylate) colloidal particles