手术取出，分离和<em&gt;在体外</em&gt;扩展人类前十字韧带衍生细胞组织工程的应用

摘要

对于未来的应用作为一个补丁来修复前交叉韧带（ACL）的部分撕裂，人类的ACL的细胞从内重建手术， 体外培养扩增和生长在组织工程支架材料获得的组织分离。然后进行细胞粘附和形态学进行确认的生物相容性支架上表面。

摘要

伤到ACL是在活跃的人经常遇到的问题。即使是部分的这个关节膝关节韧带导致的损害的功能和生物力学稳定性不足的眼泪。当前选择的部分ACL撕裂的治疗范围从非手术治疗，保守管理多个手术方案，如:热改性，单束修，彻底重建，重建原生韧带的受损部分。一些研究，如果有的话，已经证明管理是一贯出众任何单一的方法，而且在许多情况下，患者继续表现出持续的不稳定等合并症。

本研究的目的是确定可能在部分十字韧带撕裂的修复来实现一个组织工程补丁的发展潜能细胞源的利用率。一种新的协议是从不稳定型心绞痛患者的细胞膨胀发展NTS进行ACL重建。为了分离细胞，ACL重建过程中获得剁碎HACL组织被消化的胶原酶溶液。用补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素（P / S）的DMEM/F12培养基中进行扩展。然后将细胞保存在-80°C或在液氮中包括DMSO，FBS和膨胀介质的冷冻介质。融化后，将HACL衍生细胞，然后接种到组织工程支架，PLAGA（聚乳酸 - 共 - 乙醇酸）和控制组织培养聚苯乙烯（TCPS）。 7天后，扫描电镜进行到细胞粘附比拟的PLAGA与控制TCPS。采用免疫荧光染色细胞形态进行了评估。 SEM（扫描电子显微镜）显微照片表明，细胞生长和粘附这两种PLAGA和TCPS表面上，并分别由7天汇合，在整个表面上。免疫荧光染色显示正常，非胁迫形态学人图案两面上。这种技术是有前途的ACL中再生和重建应用。

引言

前交叉韧带（ACL）是膝关节的常见的受伤关节内韧带。约200,000（ACL）损伤是在美国每年报告。超过75％的患者经历ACL损伤齐齐整形重建手术^1,2,3,4。手术治疗往往是由于固有的愈合不良潜力³所示。 ACL重建通常是通过自体移植或异体移植腱的方法。自体移植和异体移植代表的金标准重建，因为他们拥有较高的成功率，并缝合修复，其他的治疗方案，已经显示出高达94％的^5,6,7故障率。

该ACL部分撕裂占10％的所有ACL的眼泪⁸ 28％。在一项前瞻性研究，诺伊斯等人估计，患者的影响超过了ACL半部分撕裂50％进展到完成的ACL功能不全后非手术治疗^9。其他的研究报告持续不稳定，并与患者能够恢复到受伤前的活动水平^{9,10,11,12,13}少于30％下降功能。治疗选择很有限，其中包括保守的方式，其余的ACL的热收缩，或ACL重建。最近，出现了增加在增强初级修复的兴趣。这些技术使用生物制剂，以加强基层缝合修复^14。最近的研究已尝试收获的间充质样HACL来源的干细胞，以规避接枝限制^，31,32，但这些细胞的效力和疗效尚属未知。理想的细胞来源，组织工程应用似乎非mesechymal HACL衍生的成纤维细胞。

目前的研究重点是确定一个合适的基质材料和细胞源工程支架。这是标准程序十字韧带撕裂被丢弃苏在重建手术rgical浪费，但是，这受损的韧带可能是一个质量的来源，收购，开发及提升工程的ACL替换一个理想的组织所需要的细胞。我们实验室已经开发出一种协议，用于体外扩增这些收获HACL来源的细胞。使用一个精心设计的二维矩阵注入HACL来源的细胞，我们设计了一个修补程序，可能会增加部分ACL修复和加强韧带撕裂。

研究方案

1，手术取出

注意:一个IRB的批准，获得在ACL重建手术来收集的ACL残端。 IRB豁免给出所使用的ACL残端一般都弃之如手术废弃物。 20例患者用于收集的ACL残端。

1. 管理全身麻醉和手术前抗生素作为每机构的协议给患者。
2. 应用止血带充气100毫克以上的收缩压。
3. 不要将病人仰卧位。做一个横向切口前外侧膝在30-45°屈曲位为5毫米的门户网站，并插入关节镜套管和相机进入髌上囊，在30℃。
4. 执行常规诊断关节镜检查。
5. 输入一个缺口，并清创膜状滑膜过十字韧带撕裂。
6. 使用4.5毫米剃须刀和消融仪来确定ACL残端。
7. 使用鸭嘴直苦收集多个SPEcimens从剩余的ACL残端。
8. 保持在生理盐水中的样品在无菌容器中。
9. 送样病理解码和最终交付给实验室设施。
10. 恢复病人和执行术后护理按机构的协议。

2，组织消化和HACL隔离

1. 传输从病理接收人的ACL组织至培养皿用无菌生理盐水/ PBS（磷酸盐缓冲盐水）。
2. 剁碎，用无菌剪刀组织成1-2毫米³条并用盐水冲洗组织糜的至少3倍。
3. 消化组织糜在DMEM/F-12 0.4％胶原酶在37℃下在补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素为4-6小时（50/50，1）培养基
4. 离心将细胞在1000×g离心5分钟，然后重悬细胞于培养基中。
5. 与介质洗2〜3次的细胞，则sEED /文化T-25瓶2-3天。

3，细胞膨胀，冻融

1. 使用光学显微镜来可视化培养细胞2-3天以T-25烧瓶中。
2. 保持在DMEM/F-12的细胞在37℃下在补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素（P / S）（50/50，1×）培养基中。
   注:更改介质时，细胞显示出坚持和标准形态。用光学显微镜观察细胞。
3. 用PBS在第7天（〜1.3×10 ⁶个细胞/瓶）洗涤汇合细胞。添加胰蛋白酶（0.5克/升），并于室温孵育在37℃下5分钟。添加媒体到悬浮细胞中和胰蛋白酶。分三路T-25瓶之间的介质的细胞混合物中。
4. 用PBS洗涤汇合细胞，添加胰蛋白酶（0.5克/升），并悬浮在其中含有DMSO，FBS和完全培养基冻存培养基（DMEM/F-12培养基+10％FBS +1％P / S）中的比1:2:7。
5. 店该低温小瓶在-80℃下，如果细胞将在一个月内使用，并在液氮中，如果细胞将被存储为更长的持续时间。
6. 解冻小瓶在37℃水浴中再利用。
   注:通常90-95％的细胞存活。

4，组织工程化的2-D聚乳酸 - 乙醇酸共聚物（PLAGA）支架的制备

1. 溶解1g PLAGA的在12毫升二氯甲烷中，在20ml的闪烁瓶中，并旋涡振荡8小时的溶液以恒定的速度（每分钟800转）。
   注:详细描述，Gupta 等人^15。
2. 转移的溶解液，以玻璃培养皿内衬含氟保护纸。
3. 将培养皿真空罩30分钟以下。留在培养皿在-20℃下过夜，然后在室温下进行。将培养皿在冻干机，以确保溶剂完全蒸发，得到的薄膜的聚合物。
4. 将聚合物网络连接LMS在干燥器中放置24小时。
5. 切聚合物薄膜成12毫米直径的圆盘，并直到需要它们存储在干燥器中。

5，扫描电子显微镜（SEM）观察

1. 洗涤细胞（50,000个细胞/盘）接种在控制TCPS和PLAGA支架用PBS7天之后播种。
2. 用在0.1M二甲胂酸盐缓冲液的1.5％戊二醛固定细胞和2.5％的OsO ₄在0.1M二甲胂酸盐缓冲液后固定。
3. 用0.1M二甲胂酸盐缓冲液洗涤固定的细胞。采用串行乙醇脱水（50％，70％，80％，90％和100％），每次15分钟，并进一步干燥以六甲基二硅氮烷（HMDS）中过夜干燥固定的细胞。
4. 发泄SEM溅射涂覆系统的腔与按钮阀，提高顶板。
5. 将干燥的样品在室中。降低顶板。
6. 切换控制旋钮，水泵开始抽真空后。
7. 打开氩气泄漏阀。等待用于真空下降至0.05毫巴。
8. 大衣干燥的样品用薄金/钯层（0.13纳米）。
9. 返回氩气泄漏阀到它的关闭位置。
10. 控制旋钮切换到关闭。
11. 发泄室与按钮阀，提高顶板。
12. 取出样品，并将其储存在干燥器中放置24小时。
13. 观察样品的扫描电子显微镜下。

6，免疫荧光染色

1. 洗涤细胞（50,000个细胞/盘）接种在控制TCPS和PLAGA支架用PBS7天之后播种。
2. 用70％乙醇（冷的）10分钟，固定细胞。
3. 孵育固定的细胞在室温下用1％牛血清白蛋白（BSA）的PBS中具有0.05％的Triton X-100的20分钟。
4. 浸没在样品中1％吐温在室温下20分钟。
5. 添加单克隆小鼠抗β-肌动蛋白抗体（1:400）孵育细胞持有者172吨，在4°C。
6. 用0.05％吐温洗细胞。二抗（山羊抗小鼠的F（ab'）的IgG 2片段结合有荧光探针，1:400）添加到细胞中，并孵育1小时，在室温下进行。
7. 用PBS洗涤细胞。染色的细胞核染色，用80％甘油安装。
8. 观察共聚焦显微镜下的细胞。

结果

的工作模式为手术取出，组织消化和人类前十字韧带（HACL）衍生细胞的分离示于图1，从外植体迁移和粘附到T-25培养瓶中的细胞。这些细胞培养3天，然后用光学显微镜（ 图2）下进行了可视化。通过7天而得到的汇合单层。健康，活细胞的存在表明HACL来源的细胞的成功的检索和文化。

细胞附着到PLAGA和TCPS的表面通过扫描电子显微镜定性测定图

讨论

这hACL/2D支架研究的主要目的是利用所获得的细胞修补，以增加局部ACL撕裂初级修复。部分ACL撕裂非手术治疗可能包括固定，支撑，循序渐进的康复计划，并定期随访评估^13,16,17的一个短周期。然而，许多研究表明，在运动员的保守治疗已经效果差和故障有关。巴克利等人对25例局部ACL的眼泪在中间随访发现，只有44％的患者在受伤前的水平恢复运动，72％的活性相关的症状^8。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Petri-dish	Fisher Scientific	08-757-103C
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994
Collagenase	Gibco	17018-029	Store at 40C
DMEM/F-12	Cellgro	10-092-CV	Store at 40C. Warm in 370C water bath before use.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10082	Store at -800C
Penicillin/Streptomycin	Lonza	17-602E	Store at 40C
Centrifuge Tubes- 15 ml	Corning	430790
T-25 flasks	BD Falcon	3013
Trypsin-Versene mixture	Lonza	17-161E	Store at 40C. Warm in 370C water bath before use.
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100	Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation.
Cryogenic vials	Corning	430489
PLAGA	Purac Biomaterials	Purasorb PLG8523	Store at -800C
TCPS disks	Fisher Scientific	12-545-82
Dichloromethane	Fisher Scientific	AC36423-0010	Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place.
Bytac paper	Saint gobin performance plastics	1420652
Scintillation vial	Fisher Scientific	03-339-21G
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906	Store at 40C
Tween	Fisher Scientific	BP337-500
mouse Anti-β-actin antibody (10 Ab)	Sigma Aldrich	A5441	Store at -200C
goat-anti-mouse antibody (20 Ab)	Cell Signaling	4408	Store at -200C
Hoechst dye	Sigma Aldrich	14530	Store at -200C
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glutaraldehyde	Fisher Scientific	BP2547-1	Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes.
Hexamethyldisilazane	Fisher Scientific	AC43085-1000	Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes.
Sterile Scissors	McKesson	25-716
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Light Microscope	Olympus	CK40
Water Bath	Thermo scientific	2845
Vortex	Labnet	VX-200
Glass Petri plates	fisher Scientific	S31473
Acu-Punch	Acuderm Inc.	P1225	Acu-Punch was used to cut 12mm disks
Cacodylate buffer	Sigma Aldrich	97068	Flammable liquid, carcinogen and irritant.
Osmium tetraoxide	Sigma Aldrich	201030	Highly toxic
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	Harmful if swallowed
Ethanol	Decon Labs	2705	Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition.
General/regional Anesthesia	Amphastar pharmaceuticals		1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance
Antibiotics	Hospira	0409-0805-01	Ancef 1g i.v.
Arthroscopy trocar	Smith and Nephew
Arthroscopy Camera	Smith and Nephew
Arthroscopic grasper and bitter	Arthrex
4.5mm shaver	Arthrex
Interference Screws	Arthrex		stainless steel screws
Sputter Coater	Polaron	E5400