אחזור כירורגי, בידוד ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הרחבת תאים הצולבות קדמי אדם נגזרים רצועה עבור יישומי הנדסת רקמות

Summary

עבור יישומים עתידיים כתיקון כדי לתקן דמעות חלקיות של הקדמית הצולבת הרצועה (ACL), תאי שמקורם ACL האנושי בודדו מרקמות שהושגו במהלך הליכים שיקומיים, הרחיבו במבחנה וגדלו על פיגומי רקמה מהונדסת. הידבקות ומורפולוגיה תאיות הייתה אז מבוצעים כדי לאשר התאמה ביולוגית על פני פיגום.

Abstract

הפגיעה ACL היא בעיה בדרך נתקלה באנשים פעילים. אפילו דמעות חלקיות של רצועה בברך להוביל תוך מפרק זה לליקויים ביומכניים הפוגעים בתפקוד ויציבות. אפשרויות הנוכחיות לטיפול בדמעות ACL החלקיים נעות בין ניהול שמרני, שמרני לאפשרויות כירורגיות מרובות, כגון: שינוי תרמי, תיקון יחיד צרור, שחזור מלא, ובנייה מחדש של החלק הפגום של רצועת הילידים. מחקרים מעטים, אם בכלל, הוכיחו בכל שיטה יחידה עבור ניהול להיות מעולה באופן עקבי, ובמקרים רבים חולים ממשיכים להפגין חוסר יציבות מתמשכת ומחלות רקע אחרות.

מטרתו של מחקר זה היא לזהות מקור תא פוטנציאל לניצול בפיתוח של תיקון רקמות מהונדסות שיכול להיות מיושם בתיקון של ACL קרוע באופן חלקי. פרוטוקול רומן פותח להרחבת התאים שמקורם patieלילות עוברים שחזור ACL. כדי לבודד את התאים, רקמות hACL טחונות שהושגו במהלך שחזור ACL היו מתעכל בפתרון Collagenase. הרחבה בוצעה באמצעות מדיום DMEM/F12 תוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S). התאים אוחסנו לאחר מכן ב-80 º C או בחנקן נוזלי בהקפאה בינונית בהיקף של DMSO, FBS ובינוני ההתרחבות. לאחר הפשרה, תאי hACL נגזרים היו אז זורעים על פיגום רקמה מהונדסת, PLAGA (לקטית, חומצה גליקולית שיתוף פולי) וקלקר תרבות רקמות שליטה (TCPS). לאחר 7 ימים, SEM בוצע כדי להשוות הידבקות סלולרית לPLAGA לעומת TCPS השליטה. מורפולוגיה תאית הוערכה באמצעות מכתים immunofluorescence. SEM micrographs (סריקת אלקטרונים מיקרוסקופ), הוכיח כי תאים גדלו ודבק בשני משטחי PLAGA וTCPS והיו מחוברות על פני כל המשטחים ביום 7. מכתים Immunofluorescence הראה מורפולוגיים רגיל, שאינו לחוץדפוסי אל על שני המשטחים. טכניקה זו מבטיחה עבור יישומים בהתחדשות ACL ובנייה מחדש.

Introduction

הרצועות הצולבות הקדמית (ACL) היא רצועת התוך מפרקים נפוצות נפצעה בברך. כ 200,000 פציעות (ACL) מדווחות מדי שנה בארצות הברית. מעל 75% מהחולים חווים opt פציעת ACL לניתוח שחזור אורתופדי ^1,2,3,4. התערבות כירורגית היא לעתים קרובות הצביעה בשל פוטנציאל ריפוי לקוי מיסודו ^3. שחזור ACL נעשה בדרך כלל באמצעות autograft או גיד של שתל. Autograft ושתל מייצגים את תקן הזהב לשיקום כפי שהם מתגאים בשיעורי הצלחה גבוהים, ותיקון תפר ראשוני, אפשרות טיפול אחרת, הראה שיעורי כישלון של עד 94% ^5,6,7.

דמעות חלקיות של ACL מייצגות 10% ל28% מכל דמעות ACL ^8. במחקר פרוספקטיבי, נויס ואח'. ההערכה היא כי 50% מהחולים עם דמעות חלקיות משפיעים על יותר ממחצית ACL התקדמו כדי להשלים ספיקת ACL לאחר איטיפול אופרטיבי ^9. מחקרים אחרים מדווחים על חוסר יציבות מתמשכת וירידה בתפקוד עם פחות מ 30% מהחולים יוכלו לחזור ^{ל9,10,11,12,13} רמת פעילות שלפני פציעתם. אפשרויות טיפול מוגבלות וכוללות שיטות שמרניות, הצטמקות תרמית של ACL שנותר, או שחזור ACL. לאחרונה, יש כבר עלה עניין בתיקון עיקרי מתוגבר. טכניקות אלה להשתמש ביולוגיים כדי לשפר את תיקוני תפר עיקריים ^14. מחקר שנערך לאחרונה ניסה לקצור hACL כמו mesenchymal נגזר בתאי גזע כדי לעקוף מגבלות שתל, ^31,32 אבל התוקף והיעילות של תאים אלה עדיין אינם ידועים. נראה מקור התא האידיאלי עבור יישומי הנדסת רקמות להיות בלתי mesechymal hACL נגזר תאי פיברובלסטים.

מחקר הנוכחי התמקד בזיהוי חומר מטריצה ​​מתאים ומקור תא לפיגום המהונדס. זה הליך סטנדרטי עבור ACL קרוע להיות מושלך כמו suפסולת rgical במהלך ניתוח שחזור, לעומת זאת, רצועה פגום עשויה להיות מקור באיכות לרכישת התאים הדרושים כדי לפתח ולשפר את רקמה מהונדסת אידיאלית החלפת ACL. המעבדה שלנו פיתחה פרוטוקול להרחבה במבחנה של תאי hACL נקטפו אלה נגזרים. שימוש במטריצת 2D מהונדס רווי תאי hACL נגזרים, עיצבנו תיקון שעלול להגדיל את תיקון ACL חלקי ולחזק את הרצועות קרועות.

Protocol

1. אחזור כירורגי

הערה: אישור IRB הושג לאסוף את גדם ACL במהלך ניתוח שחזור ACL. פטור IRB ניתנו כגדם ACL משמש, בדרך כלל, מושלך כפסולת כירורגית. 20 חולים שימשו כדי לאסוף את גדם ACL.

1. לנהל הרדמה כללית ואנטיביוטיקה לפני ניתוח לפי הפרוטוקול של מוסד למטופל.
2. החל חוסם עורקים ולנפח מעל לחץ דם הסיסטולי 100 מ"ג.
3. למקם את המטופל במצב שכיבה. לעשות חתך anterolateral אופקי עם הברך בכיפוף ° 30-45 לפורטל 5 מ"מ ולהכניס נקז ארתרוסקופי ומצלמה לתוך כיס suprapatellar ב30 מעלות.
4. לבצע ארתרוסקופיה אבחון שגרתית.
5. הזן ברמה גבוהה וdebride הסינוביום הקרומי על ACL הקרוע.
6. השתמש במכונת גילוח 4.5 מ"מ וablator לזהות את גדם ACL.
7. השתמש במקור ברווז ישר מרים לאסוף SPE מרובהcimens מגדם ACL הנותר.
8. לשמור על המדגם במלח רגיל במכל סטרילי.
9. שלח את הדגימות לפתולוגיה לפענוח ואספקה ​​סופית למתקן במעבדה.
10. לשחזר מטופל ולבצע טיפול שלאחר ניתוח לפי הפרוטוקול של המוסד.

2. עיכול רקמות ובידוד hACL

1. העברת רקמת ACL האדם קיבלה מהפתולוגיה בצלחת פטרי עם תמיסת מלח סטרילית / PBS (פוספט שנאגרו מלוח).
2. לרכך את הרקמה באמצעות מספריים סטרילי לתוך 1-2 מ"מ ³ חתיכות ולשטוף את הרקמה הטחון עם מי מלח לפחות 3 פעמים.
3. לעכל את הרקמה הטחון עם Collagenase 0.4% בDMEM/F-12 (50/50, 1x) בינוני בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין ל4-6 שעות על 37 ° C.
4. צנטריפוגה התאים XG ב 1000 למשך 5 דקות ולאחר מכן resuspend התאים במדיום.
5. לשטוף את התאים עם המדיום ל2-3 פעמים ולאחר מכן seed / תרבות בT-25 צלוחיות ל2-3 ימים.

3. ההרחבה נייד, הקפאה להפשרה

1. השתמש במיקרוסקופ אור כדי להמחיש את התאים בתרבית למשך 2-3 ימים בבקבוק T-25.
2. לשמור על התאים ב37 מעלות צלזיוס בDMEM/F-12 (50/50, 1x) הבינוני בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S).
   הערה: שנה את התקשורת כאשר תאים להראות דבקות ומורפולוגיה סטנדרטית. השתמש במיקרוסקופ אור כדי לבחון את התאים.
3. שוטף את התאים ומחוברות עם PBS ביום 7 (~ 1.3 X 10 ⁶ תאים / בקבוק). הוספת טריפסין (0.5 g / L) ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הוסף מדיה לתאים הושעו לנטרל טריפסין. מחלקים את תערובת מדיה התאים בין שלוש T-25 צלוחיות.
4. שוטף את התאים ומחוברות עם PBS, להוסיף טריפסין (0.5 גר '/ ל'), וresuspend אותם בהקפאת מדיום המכיל DMSO, FBS ובינוני המלא (DMEM/F-12 בינוני + 10% P FBS 1% + / S) ב 1:02:07 יחס.
5. חנותבקבוקוני קריוגני ב -80 ° C אם התאים ישמשו בתוך חודש, ובחנקן נוזלי, אם התאים יישמרו במשך תקופות ארוכות.
6. להפשיר את המבחנות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לשימוש חוזר.
   הערה: בדרך כלל תאי 90-95% לשרוד.

4. ייצור של רקמות מהונדסות 2-D לקטית, חומצה גליקולית שיתוף פולי פיגום (PLAGA)

1. להמס 1 גרם של PLAGA ב12 מיליליטר dichloromethane בבקבוקון נצנץ 20 מיליליטר ומערבולת הפתרון במשך 8 שעות במהירות קבועה (800 סל"ד).
   הערה: תיאור פרטני בגופטה ואח' ^15.
2. מעביר את הפתרון המומס לצלחת פטרי זכוכית מרופדת בנייר הגנת Fluorinated.
3. מניחים את צלחת פטרי מתחת למכסת מנוע ואקום ל30 דקות. השאר את צלחת פטרי ב -20 מעלות צלזיוס למשך לילה ולאחר מכן בטמפרטורת חדר. הנח את צלחות פטרי בlyophilizer כדי להבטיח אידוי של הממס מלא להשיג סרטים דקים של הפולימר.
4. הנח בדיוני הפולימרLMS בייבוש ל24 שעות.
5. חותכים את סרטי פולימר ל12 דיסקים עגולים בקוטר מ"מ ולאחסן אותם בתא ייבוש עד צורך.

5. סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים (SEM)

1. לשטוף את התאים (50,000 תאים / דיסק) זורעים על TCPS השליטה ופיגום PLAGA עם PBS 7 ימים לאחר זריעה.
2. השתמש glutaraldehyde 1.5% במאגר M 0.1 cacodylate לתקן תאים ו2.5% Oso ₄ במאגר M 0.1 cacodylate להודעה קיבעון.
3. לשטוף את התאים הקבועים עם מאגר M 0.1 cacodylate. ייבש את התאים הקבועים באמצעות התייבשות סידורי אתנול (50%, 70%, 80%, 90% ו100%) ל15 דקות כל אחד, ועוד יותר יבש בHexamethyldisilazane (HMDS) למשך לילה.
4. Vent הקאמרית של מערכת ציפוי גמגום SEM עם שסתום לחץ ולהעלות את הצלחת העליונה.
5. מניחים את הדגימות יבשות בחדר. מנמיכים את הצלחת העליונה.
6. לעבור את ידית השליטה לשאוב כדי להתחיל בפינוי החדר.
7. שסתום דליפת ארגון פתח. חכהלוואקום לרדת ל 0.05 mbar.
8. דגימות המעיל היבשים בשכבה דקה (0.13 ננומטר) של זהב / פלדיום.
9. להחזיר את שסתום דליפת ארגון למצב הסגור שלה.
10. לעבור את ידית שליטה לכבויה.
11. Vent קאמרי עם שסתום לחץ ולהעלות את הצלחת העליונה.
12. הסר את הדגימות ולאחסן אותם בתא ייבוש ל24 שעות.
13. שים לב הדגימות תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

6. Immunofluorescence מכתים

1. לשטוף את התאים (50,000 תאים / דיסק) זורעים על TCPS השליטה ופיגום PLAGA עם PBS 7 ימים לאחר זריעה.
2. תקן את התאים באמצעות 70% אתנול (קר) ל10 דקות.
3. דגירה התאים הקבועים בטמפרטורת חדר עם 1% הסרום אלבומין שור (BSA) ב-PBS שיש 0.05% טריטון X-100 עבור 20 דקות.
4. לטבול את הדגימות בTween 1% בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות.
5. הוסף נוגדן חד שבטי עכבר Anti-β-אקטין (1:400) ודגירת התאים overnighלא ב 4 ° C.
6. לשטוף את התאים עם Tween 0.05%. הוספת נוגדנים משני (עז אנטי העכבר F (ab ') 2 שבר של IgG מצומדות עם בדיקה הקרינה, 1:400) לתאי דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
7. לשטוף את התאים עם PBS. כתם התאים עם כתם גרעיני והר באמצעות 80% גליצרול.
8. שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ confocal.

תוצאות

מודל העבודה לאחזור כירורגית, עיכול רקמה ובידוד של הקדמית הצולבת הרצועה האנושית (hACL) תאי שמקורם מוצג באיור 1. התאים הגרו מexplants ודבקו בחולצת 25 צלוחיות. תאים אלה היו בתרבית במשך 3 ימים ולאחר מכן היו דמיינו תחת מיקרוסקופ אור (איור 2). Monolayer מחוברות הושג ביו?...

Discussion

המטרה העיקרית של מחקר פיגום hACL/2D זה הייתה להשתמש בתאים שהתקבלו בתיקון כדי להגדיל את התיקון עיקרי של דמעות ACL חלקיות. ניהול שמרני של דמעות ACL חלקיות עשוי לכלול תקופה קצרה של חוסר תנועה, מחזק אותו, תכנית שיקום מתקדמת, והערכות מעקב קבועות ^13,16,17. עם זאת, מחקרים רבים מרא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Petri-dish	Fisher Scientific	08-757-103C
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994
Collagenase	Gibco	17018-029	Store at 40C
DMEM/F-12	Cellgro	10-092-CV	Store at 40C. Warm in 370C water bath before use.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10082	Store at -800C
Penicillin/Streptomycin	Lonza	17-602E	Store at 40C
Centrifuge Tubes- 15 ml	Corning	430790
T-25 flasks	BD Falcon	3013
Trypsin-Versene mixture	Lonza	17-161E	Store at 40C. Warm in 370C water bath before use.
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100	Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation.
Cryogenic vials	Corning	430489
PLAGA	Purac Biomaterials	Purasorb PLG8523	Store at -800C
TCPS disks	Fisher Scientific	12-545-82
Dichloromethane	Fisher Scientific	AC36423-0010	Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place.
Bytac paper	Saint gobin performance plastics	1420652
Scintillation vial	Fisher Scientific	03-339-21G
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906	Store at 40C
Tween	Fisher Scientific	BP337-500
mouse Anti-β-actin antibody (10 Ab)	Sigma Aldrich	A5441	Store at -200C
goat-anti-mouse antibody (20 Ab)	Cell Signaling	4408	Store at -200C
Hoechst dye	Sigma Aldrich	14530	Store at -200C
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glutaraldehyde	Fisher Scientific	BP2547-1	Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes.
Hexamethyldisilazane	Fisher Scientific	AC43085-1000	Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes.
Sterile Scissors	McKesson	25-716
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Light Microscope	Olympus	CK40
Water Bath	Thermo scientific	2845
Vortex	Labnet	VX-200
Glass Petri plates	fisher Scientific	S31473
Acu-Punch	Acuderm Inc.	P1225	Acu-Punch was used to cut 12mm disks
Cacodylate buffer	Sigma Aldrich	97068	Flammable liquid, carcinogen and irritant.
Osmium tetraoxide	Sigma Aldrich	201030	Highly toxic
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	Harmful if swallowed
Ethanol	Decon Labs	2705	Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition.
General/regional Anesthesia	Amphastar pharmaceuticals		1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance
Antibiotics	Hospira	0409-0805-01	Ancef 1g i.v.
Arthroscopy trocar	Smith and Nephew
Arthroscopy Camera	Smith and Nephew
Arthroscopic grasper and bitter	Arthrex
4.5mm shaver	Arthrex
Interference Screws	Arthrex		stainless steel screws
Sputter Coater	Polaron	E5400