外科用回収、単離と<em&gt;インビトロ</em&gt;組織工学アプリケーションのためのヒト前十字靭帯由来細胞の拡大

要約

前十字靭帯（ACL）の部分的な涙を修復するためのパッチなど、将来のアプリケーションでは、人間のACL由来の細胞をin vitroで増殖し、組織工学足場上に成長させ、再建手続きの際に得られた組織から単離した。細胞接着および形態は、その後、足場表面上に生体適合性を確認した。

要約

ACLに損傷がアクティブの個体において一般的に発生する問題です。機能性と安定性を損なう生体力学的な欠陥は、この関節膝靭帯リードのさえ部分的な涙。熱修正、シングルバンドルの修復、完全な復興、およびネイティブ靭帯の損傷部分の再構築：部分的なACLの涙の治療のための現在のオプションは保存療法、保守的な経営陣からのような複数の外科オプションの範囲。いくつかの研究は、もしあれば、一貫して優れていると管理のための任意の単一の方法を実証しており、多くの場合、患者は、永続的な不安定性および他の併存疾患を実証し続ける。

本研究の目的は、部分的に引き裂かれたACLの修復に実施することができる組織工学パッチの開発に利用するための潜在的な細胞源を同定することである。新規プロトコルはpatieに由来する細胞の拡大のために開発されましたACL再建を受けてNTS。細胞を単離するために、ACL再建中に得られたミンチHACL組織をコラゲナーゼ溶液中で消化した。膨張は、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したDMEM/F12培地および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）を用いて行った。次いで、細胞をDMSO、FBSおよび拡張培地からなる凍結培地中に-80℃で、または液体窒素中で保存した。解凍後、HACL由来細胞は、次いで、組織工学的足場、PLAGA（ポリ乳酸 - コ - グリコール酸）および対照組織培養ポリスチレン（TCPS）上に播種した。 7日後、SEMを制御TCPSに対するPLAGAに対する細胞接着性を比較した。細胞形態は、免疫蛍光染色を用いて評価した。 SEM（走査型電子顕微鏡）顕微鏡写真は、細胞が成長し、PLAGAおよびTCPS両面に付着し、7日目で全面にコンフルエントことを明らかにした。免疫蛍光染色は、通常、非ストレス形態学を示した両面にアルミニウムパターン。この手法は、ACLの再生·復興への応用が期待されている。

概要

前十字靱帯（ACL）は膝の一般負傷した関節内靭帯である。約20万（ACL）の傷害は、米国で毎年報告されています。整形外科再建手術^1,2,3,4のACL損傷OPTを経験した患者の75％以上。外科的介入は、しばしば本質的に治癒不良の可能性³に示されている。 ACL再建は、典型的には、自家移植片又は同種移植腱によって達成される。自家移植と同種移植片は、高い成功率を誇るように復興のためのゴールドスタンダードを表し、一次縫合の修理、他の治療オプションは、最大で94％で^5,6,7の故障率を示している。

ACLの部分的な涙はすべてのACLの涙⁸の28％、10％に相当する。プロスペクティブ研究では、ノイスら 、よりACLの半分以上の部分に影響を与える涙を有する患者の50％が後、非ACL不全を完了するために進行していると推定手術治療^9。他の研究では、持続的な不安定性を報告し、その損傷前の活動レベル^{9,10,11,12,13}に戻ることができた患者の30％未満で機能の低下。治療の選択肢は限られており、保守的な様式、残りのACLの熱収縮、またはACL再建が含まれています。最近では、拡張現実、一次修理に対する関心が高まっています。これらの技術は、一次縫合糸修復^14を強化するために生物学的製剤を使用しています。最近の研究では、間葉系様HACLを収穫しようとした^31,32、移植の制限を回避するために幹細胞を誘導されたが、これらの細胞の妥当性と有効性はまだ不明です。組織工学用途のための理想的な細胞源は、非mesechymal HACLは、線維芽細胞に由来すると思われる。

現在の研究は、適切なマトリックス材料および操作された足場のための細胞源の同定に焦点を当てている。引き裂かれたACLは、suとして廃棄されることが標準的な手順である再建手術中rgical廃棄物は、しかし、この損傷を受けた靭帯は、ACL置換を設計し、理想的な組織を開発し、強化するために必要な細胞の取得質源であってもよい。私たちの研究室では、これらを採取HACL由来細胞のin vitroでの拡大のためのプロトコルを開発しました。 HACL由来細胞を注入された設計の2Dマトリックスを使用して、我々は潜在的に部分的なACLの修復を増強し、引き裂かれた靭帯を強化する可能性がパッチを設計しました。

プロトコル

1。手術検索

注：IRB承認がACL再建手術中にACL断端を収集するために得た。使用するACL断端は一般外科廃棄物として廃棄されたように、IRBの免除が与えられた。 20人の患者は、ACL断端を収集するために使用された。

1. 患者への金融機関のプロトコールに従って、全身麻酔や手術前の抗生物質を管理します。
2. 止血帯を適用し、収縮期血圧が上100ミリグラムを膨らませる。
3. 仰臥位で患者を置く。 5ミリメートルポータルの30〜45°の屈曲で膝水平前外側切開を行い、30℃で膝蓋上パウチに関節鏡トロカールとカメラを挿入します。
4. 日常的な診断関節鏡検査を実行します。
5. ノッチを入力して、引き裂かれたACLより膜性滑膜を創面切除。
6. ACL断を識別するために、4.5ミリメートルのシェーバーとアブレータを使用してください。
7. 複数のSPEを収集するためにまっすぐに苦いダックビルを使用残りのACL断からcimens。
8. 滅菌容器に生理食塩水のサンプルを維持する。
9. デコードや実験施設への最終的な配信のために病理学にサンプルを送る。
10. 患者を回復し、金融機関のプロトコールに従って術後ケアを行う。

2。組織消化とHACLの分離

1. 人間のACL組織は、（リン酸緩衝生理食塩水）滅菌生理食塩水/ PBSでシャーレに病理から受信した転送。
2. 1〜2ミリメートル³個に、滅菌ハサミで組織をミンチし、少なくとも3回の生理食塩水でみじん切り組織を洗う。
3. DMEM/F-12中の0.4％コラゲナーゼで37℃で4-6時間、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した（50/50、1×）培地で細分化した組織を消化
4. 5分間の千×gで細胞を遠心分離した後、培地中で細胞を再懸濁。
5. Sそれから2〜3回培地で細胞を洗浄し、EED / 2〜3日のT-25フラスコ内の培養。

3。細胞拡大、凍結融解

1. T-25フラスコ内で2〜3日間培養した細胞を可視化するために光学顕微鏡を使用しています。
2. 10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）を補充したDMEM/F-12（50/50、1×）培地中37℃で細胞を維持する。
   注意：細胞が接着および標準形態を示すときに、メディアを変更します。細胞を観察するために光学顕微鏡を使用しています。
3. 7日目（〜1.3×10 ⁶細胞/フラスコ）にPBSでコンフルエントの細胞を洗浄します。トリプシン（0.5グラム/ L）を添加し、5分間37℃で細胞をインキュベートする。トリプシンを中和するために懸濁された細胞にメディアを追加。 3、T-25フラスコの間のメディア細胞の混合物を分割します。
4. PBSでコンフルエントの細胞を洗浄し、トリプシン（0.5グラム/ L）を追加し、DMSO、FBSおよび完全培地（DMEM/F-12培地+、10％FBS +1％P / S）を含む凍結培地で再懸濁します比率午前1時02分07秒。
5. 店細胞は、より長い時間保存される場合に細胞はヶ月以内に使用され、液体窒素中で説明する場合は-80℃での低温バイアル。
6. 再利用のために37℃の水浴中でバイアルを解凍する。
   注：通常90から95パーセントの細胞が生存。

4。2-Dポリ乳酸 - コ - グリコール酸（PLAGA）組織工学的足場の作製

1. 20ミリリットルのシンチレーションバイアル中の12ミリリットルのジクロロメタンにPLAGAの1グラムを溶解し、一定速度（800 rpm）で8時間のためのソリューションをボルテックスする。
   注意：グプタら詳細な説明^15。
2. フッ素系保護紙を敷いたガラスシャーレに溶解した溶液を転送します。
3. 30分間真空フードの下にペトリ皿を置きます。室温で一晩、その後-20℃でペトリ皿のままにしておきます。ポリマーの薄膜を得るために、溶媒を完全に蒸発を確実にするために凍結乾燥機中でペトリ皿を置きます。
4. ポリマーFIを配置します24時間デシケーター中LMS。
5. 直径12mmの円形ディスクにポリマーフィルムをカットし、必要になるまでデシケーターに保管してください。

5。走査型電子顕微鏡（SEM）

1. 細胞（50,000細胞/ディスク）を洗って播種7日以降のPBSで制御TCPSとPLAGA足場に播種。
2. 細胞を固定し、後固定のための0.1M酸緩衝液中で2.5％のOsO ₄を0.1M酸緩衝液中で1.5％のグルタルアルデヒドを使用してください。
3. 0.1Mの酸緩衝液で固定した細胞を洗浄します。それぞれ15分、そして一晩ヘキサメチルジシラザン（HMDS）中でさらに乾燥シリアルエタノール脱水（50％、70％、80％、90％及び100％）を用いて固定した細胞を乾燥させる。
4. ボタンバルブを、SEMスパッタコーティングシステムのチャンバーをベントし、天板を上げる。
5. 室内で乾燥させた試料を配置します。天板を下げます。
6. チャンバを排気開始するために圧送するコントロールノブを切り替えます。
7. オープンアルゴンリーク弁。待つ真空は0.05ミリバールまで低下させるには。
8. 金/パラジウムの薄い層（0.13ナノメートル）でコーティング乾燥した試料。
9. その閉じた位置にアルゴンリーク弁を返します。
10. オフにコントロールノブを切り替えます。
11. ボタンバルブとチャンバーベント天板を上げる。
12. サンプルを取り出して、24時間デシケーターに保管してください。
13. 走査型電子顕微鏡でサンプルを観察します。

6。免疫蛍光染色

1. 細胞（50,000細胞/ディスク）を洗って播種7日以降のPBSで制御TCPSとPLAGA足場に播種。
2. 10分間、70％エタノール（コールド）を用いて細胞を固定します。
3. PBSで20分間、0.05％トリトンX-100を有する中の1％ウシ血清アルブミン（BSA）を用いて室温で固定した細胞をインキュベートする。
4. 20分間室温で1％Tween中のサンプルを浸す。
5. モノクローナルマウス抗β-アクチン抗体（1:400）を追加し、overnigh細胞をインキュベート4℃でのT
6. 0.05％のTweenで細胞を洗浄。細胞への二次抗体（抗マウスF（ab 'ヤギ）蛍光プローブ、1:400と結合したIgGの2断片）を添加し、室温で1時間インキュベートする。
7. PBSで細胞を洗浄。核染色で細胞を染色し、80％グリセロールを使用してマウントします。
8. 共焦点顕微鏡で細胞を観察します。

結果

外科用回収、組織消化し ​​、ヒト前十字靭帯（HACL）由来細胞の単離のためのワーキングモデルを図1に示す。外植片から移行し、T-25フラスコに付着した細胞を。これらの細胞を3日間培養し、光学顕微鏡（ 図2）の下で可視化した。コンフルエントな単層を、7日目までに得た。健康な、生存細胞の存在はHACL由来細胞の正常な取得および培養を示す。

ディスカッション

このhACL/2D足場研究の主な目的は、部分的なACLの涙の主要な修理を強化するために、パッチで得られた細胞を使用することでした。部分的なACLの涙の非手術管理が固定化、ブレーシング、進歩的リハビリテーションプログラム、および定期的なフォローアップの評価^13,16,17の短期間を含むことができる。しかし、多くの研究がスポーツ選手での保存的治療が不十分な結果、失敗と関​?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Petri-dish	Fisher Scientific	08-757-103C
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994
Collagenase	Gibco	17018-029	Store at 40C
DMEM/F-12	Cellgro	10-092-CV	Store at 40C. Warm in 370C water bath before use.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10082	Store at -800C
Penicillin/Streptomycin	Lonza	17-602E	Store at 40C
Centrifuge Tubes- 15 ml	Corning	430790
T-25 flasks	BD Falcon	3013
Trypsin-Versene mixture	Lonza	17-161E	Store at 40C. Warm in 370C water bath before use.
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100	Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation.
Cryogenic vials	Corning	430489
PLAGA	Purac Biomaterials	Purasorb PLG8523	Store at -800C
TCPS disks	Fisher Scientific	12-545-82
Dichloromethane	Fisher Scientific	AC36423-0010	Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place.
Bytac paper	Saint gobin performance plastics	1420652
Scintillation vial	Fisher Scientific	03-339-21G
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906	Store at 40C
Tween	Fisher Scientific	BP337-500
mouse Anti-β-actin antibody (10 Ab)	Sigma Aldrich	A5441	Store at -200C
goat-anti-mouse antibody (20 Ab)	Cell Signaling	4408	Store at -200C
Hoechst dye	Sigma Aldrich	14530	Store at -200C
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glutaraldehyde	Fisher Scientific	BP2547-1	Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes.
Hexamethyldisilazane	Fisher Scientific	AC43085-1000	Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes.
Sterile Scissors	McKesson	25-716
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Light Microscope	Olympus	CK40
Water Bath	Thermo scientific	2845
Vortex	Labnet	VX-200
Glass Petri plates	fisher Scientific	S31473
Acu-Punch	Acuderm Inc.	P1225	Acu-Punch was used to cut 12mm disks
Cacodylate buffer	Sigma Aldrich	97068	Flammable liquid, carcinogen and irritant.
Osmium tetraoxide	Sigma Aldrich	201030	Highly toxic
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	Harmful if swallowed
Ethanol	Decon Labs	2705	Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition.
General/regional Anesthesia	Amphastar pharmaceuticals		1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance
Antibiotics	Hospira	0409-0805-01	Ancef 1g i.v.
Arthroscopy trocar	Smith and Nephew
Arthroscopy Camera	Smith and Nephew
Arthroscopic grasper and bitter	Arthrex
4.5mm shaver	Arthrex
Interference Screws	Arthrex		stainless steel screws
Sputter Coater	Polaron	E5400