Chirurgische Retrieval, Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Erweiterung des menschlichen vorderen Kreuzbandes abgeleiteten Zellen für Tissue Engineering Anwendungen

Zusammenfassung

Für zukünftige Anwendungen als Patch zu Teil Tränen des vorderen Kreuzbandes (ACL) zu reparieren, wurden menschliche ACL abgeleitet von Zellen während rekonstruktive Verfahren, in vitro erweitert und Tissue Engineering Scaffolds gewachsen erhalten Gewebe isoliert. Zelladhäsion und Morphologie wurde dann durchgeführt, um die Biokompatibilität auf Gerüstoberfläche bestätigen.

Zusammenfassung

Eine Verletzung des ACL ist ein häufig auftretendes Problem in aktive Menschen. Selbst eine teilweise Tränen dieser intraartikuläre Kreuzbandriss führen zu biomechanischen Mängel, die Funktion und Stabilität beeinträchtigen. Aktuelle Optionen für die Behandlung von partiellen ACL Tränen reichen von nicht-operative, konservative Behandlung, mehrere chirurgische Optionen, wie: thermische Änderung, Single-Bundle Reparatur, komplette Rekonstruktion und Wiederaufbau des beschädigten Teil der einheimischen Band. Nur wenige Studien, wenn überhaupt, haben jede einzelne Methode für das Management konsequent überlegen gezeigt, und in vielen Fällen Patienten weiterhin anhaltende Instabilität und andere Begleiterkrankungen zu demonstrieren.

Das Ziel dieser Studie ist, um eine mögliche Zellquelle für die Verwendung in der Entwicklung eines mittels Tissue Engineering Patch, der bei der Reparatur einer teilweise abgerissen ACL implementiert werden könnten. Ein neuartiges Protokoll wurde für den Ausbau von Zellen aus patie abgeleitet entwickeltnts ACL-Rekonstruktion unterzogen. Um die Zellen zu isolieren, wurde gehackt während ACL-Rekonstruktion erhalten HACL Gewebe in einer Collagenase-Lösung verdaut. Expansion wurde unter Verwendung von DMEM/F12 Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S) ergänzt. Die Zellen wurden dann bei -80 º C oder in flüssigem Stickstoff in einem Gefriermedium, bestehend aus DMSO, FBS und dem Expansionsmedium gespeichert. Nach dem Auftauen wurden die HACL abgeleiteten Zellen dann auf ein Gerüst aus Gewebezüchtungen, PLAGA (Poly Milch-co-Glykolsäure) und Steuergewebekultur-Polystyrol (TCPS) ausgesät. Nach 7 Tagen wurde SEM durchgeführt, um die zelluläre Adhäsion zu der PLAGA TCPS gegenüber der Kontrolle zu vergleichen. Zellmorphologie wurde mit Immunfluoreszenzfärbung ausgewertet. SEM (Rasterelektronenmikroskop) Mikroaufnahmen zeigten, dass Zellen wuchsen und auf beiden PLAGA und TCPS Oberflächen haften und wurden von Tag 7 über die gesamten Oberflächen konfluent. Immunfluoreszenzfärbung zeigten normale, unbelastete morphologischenal Muster auf beiden Oberflächen. Diese Technik ist vielversprechend für Anwendungen in der ACL Regeneration und Rekonstruktion.

Einleitung

Das vordere Kreuzband (ACL) ist ein häufig verletzt intraartikuläre Bandes des Knies. Rund 200.000 (ACL) Verletzungen werden jährlich in den Vereinigten Staaten berichtet. Über 75% der Patienten mit ACL-Verletzung opt für orthopädische rekonstruktive Chirurgie ^1,2,3,4. Der chirurgische Eingriff wird häufig aufgrund einer von Natur aus schlechter Heilungspotential ³ angegeben. ACL-Rekonstruktion wird typischerweise mittels eines autologen oder allogenen Sehnen erreicht. Autograft und Allograft stellen den Goldstandard für die Rekonstruktion, wie sie rühmen, hohe Erfolgsquoten und primäre Naht zu reparieren, die andere Behandlungsoption hat Ausfallraten von bis zu 94% ^5,6,7 dargestellt.

Teilweise Tränen der ACL repräsentieren 10% bis 28% aller ACL Tränen ^8. In einer prospektiven Studie, Noyes et al. Geschätzt, dass 50% der Patienten mit teilweise Tränen, die mehr als die Hälfte der ACL ACL fortgeschritten Insuffizienz abgeschlossen, nachdem nicht-operativen Behandlung ^9. Andere Studien berichten von anhaltenden Instabilität und verminderte Funktion mit weniger als 30% der Patienten in der Lage, ihre vor der Verletzung Aktivität ^{9,10,11,12,13} zurückzukehren. Die Behandlungsmöglichkeiten sind begrenzt und umfassen konservative Modalitäten, thermische Schrumpfung der restlichen ACL, ACL oder Wiederaufbau. Kürzlich gab, wurde erhöht Zinsen in Augmented primären Reparatur. Diese Techniken verwenden, um Biologika primäre Naht Reparaturen ¹⁴ zu verbessern. Die neuere Forschung hat versucht, ernten mesenchymalen artigen HACL Stammzellen zu Transplantat Einschränkungen zu umgehen, ^31,32 aber die Gültigkeit und Wirksamkeit dieser Zellen ist noch unbekannt. Die ideale Zellquelle für das Tissue Engineering-Anwendungen scheint nicht mesechymal HACL abgeleitet Fibroblasten-Zellen sein.

Die aktuelle Forschung auf die Identifizierung eines geeigneten Matrixmaterial und Zellquelle für das Gerüst entwickelt, konzentriert. Es ist das übliche Verfahren für einen Kreuzbandriss als su verworfen werdenrgical Abfälle während der Wiederherstellungschirurgie, aber diese beschädigten Band kann eine hochwertige Quelle für den Erwerb von Zellen für die Entwicklung und Verbesserung der ideale Gewebezüchtungen ACL-Ersatz. Unser Labor hat ein Protokoll für die in vitro-Expansion dieser Zellen geerntet HACL abgeleitet entwickelt. Mit einer 2D-Matrix entwickelt, mit HACL abgeleiteten Zellen infundiert haben wir einen Patch, der potenziell verstärken könnte teilweise ACL Reparatur und stärken Bänderriss entworfen.

Protokoll

1. Chirurgische Retrieval

Hinweis: Ein IRB-Zulassung erhalten, um die ACL Stumpf während ACL-Rekonstruktion Chirurgie zu sammeln. IRB-Befreiung gegeben wurde, wie die ACL-Stumpf verwendet wurden, in der Regel als Operationsmüll. 20 Patienten wurden verwendet, um die ACL-Stumpf zu sammeln.

1. Verwalten allgemeine Anästhesie und präoperative Antibiotika als Per-Protokoll-Instituts für den Patienten.
2. Bewerben Tourniquet und pumpen 100 mg über den systolischen Blutdruck.
3. Situate den Patienten in der Rückenlage. Machen Sie eine horizontale anterolaterale Inzision mit Knie in 30-45 ° Beugung für ein 5-mm-Portal und legen Sie die arthroskopische Trokar und Kamera in die Tasche suprapatellaris bei 30 °.
4. Führen Sie eine der Routinediagnostik Arthroskopie.
5. Geben Sie eine Kerbe und debride die membranöse Gelenkinnenhaut über den Kreuzbandriss.
6. Verwenden Sie einen 4,5 mm Rasierer und Ablator die ACL Stumpf zu identifizieren.
7. Verwenden Sie einen Entenschnabel gerade bitter, mehrere spe sammelncimens von der verbliebenen ACL-Stumpf.
8. Aufrechterhaltung der Probe in normaler Kochsalzlösung in einem sterilen Behälter.
9. Senden Sie die Proben zur Pathologie zum Decodieren und Auslieferung an die Laboranlage.
10. Recover Patienten und durchzuführen, post-operative Betreuung laut Protokoll Institution.

2. Tissue Verdauung und HACL Isolation

1. Übertragung der aus der Pathologie empfangenen ACL menschlichen Gewebes in eine Petrischale mit einer sterilen Kochsalzlösung / PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung).
2. Hackfleisch mit sterilen Schere das Gewebe in 1-2 mm ³ Stücke und waschen Sie die zerkleinerte Gewebe mit Kochsalzlösung mindestens 3 Mal.
3. Digest des zerkleinerten Gewebes mit 0,4% Collagenase in DMEM/F-12 (50/50, 1x) Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin ergänzt für 4-6 h bei 37 ° C.
4. Zentrifugieren der Zellen bei 1000 × g für 5 Minuten und Resuspendieren der Zellen in dem Medium dann.
5. Waschen der Zellen mit dem Medium für 2-3 mal und dann seed / Kultur in T-25-Kolben für 2-3 Tage.

3. Cellular Expansion, Einfrieren und Auftauen

1. Verwenden eines Lichtmikroskops, die Zellen für 2-3 Tage kultiviert, in einem T-25-Kolben visualisieren.
2. Pflegen der Zellen bei 37 ° C in DMEM/F-12 (50/50, 1x) Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S) ergänzt.
   Hinweis: Ändern Sie die Medien, wenn die Zellen zeigen Einhaltung und Standard-Morphologie. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um die Zellen zu beobachten.
3. Waschen der konfluenten Zellen mit PBS am Tag 7 (~ 1,3 × 10 ⁶ Zellen / Kolben). Hinzufügen Trypsin (0,5 g / l) und Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für 5 min. In Medien suspendierten Zellen Trypsin zu neutralisieren. Teilen Sie die Medien-Zellgemisch zwischen drei T-25-Kolben.
4. Waschen der konfluenten Zellen mit PBS, fügen Trypsin (0,5 g / l) und resuspendieren sie in Gefriermedium enthält, DMSO, FBS und das Vollmedium (DMEM/F-12 Medium + 10% FBS + 1% P / S) in der Verhältnis 01.02.07.
5. SpeicherDie kryogene Fläschchen bei -80 ° C, wenn die Zellen innerhalb eines Monats verwendet werden und in flüssigem Stickstoff, wenn die Zellen für längere Laufzeiten gespeichert werden.
6. Tauen Sie die Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad zur Wiederverwendung.
   Hinweis: In der Regel 90-95% der Zellen überleben.

4. Herstellung von Tissue Engineered 2-D-Milch Poly-co-Glykolsäure (PLAGA) Gerüst

1. Man löst 1 g PLAGA in 12 ml Dichlormethan in einem 20 ml-Szintillations-Fläschchen und verwirbeln die Lösung für 8 h bei einer konstanten Geschwindigkeit (800 UpM).
   Hinweis: Detaillierte Beschreibung in Gupta et al ^15.
2. Übertragen Sie die gelöste Lösung auf eine Glaspetrischale mit Fluorierte Schutzpapier ausgekleidet.
3. Legen Sie die Petrischale unter einer Vakuumhaube für 30 min. Verlassen die Petrischale bei 20 ° C über Nacht und dann bei Raumtemperatur. Platzieren Sie die Petrischalen in den Lyophilisator vollständige Verdampfung des Lösungsmittels zu gewährleisten, dünne Filme des Polymers zu erhalten.
4. Legen Sie das Polymer fiLMS in einem Exsikkator für 24 Stunden.
5. Schneiden Sie die Polymerfilme in 12 mm Durchmesser Kreisscheiben und speichern sie in einem Exsikkator, bis sie benötigt.

5. Rasterelektronenmikroskopie (SEM)

1. Waschen Sie die Zellen (50.000 Zellen / Platte) ausgesät auf der Steuer TCPS und dem PLAGA Gerüst mit PBS 7 Tage im Anschluss an Aussaat.
2. Verwenden von 1,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer, um die Zellen zu fixieren und 2,5% OsO ₄ in 0,1 M Cacodylatpuffer für Postfixierung.
3. Mit 0,1 M Cacodylatpuffer Waschen der fixierten Zellen. Trocknen der fixierten Zellen mit seriellen Ethanol-Dehydratisierung (50%, 70%, 80%, 90% und 100%) für 15 min jeweils, und ferner trocken in Hexamethyldisilazan (HMDS) über Nacht.
4. Entlüften Sie die Kammer des SEM-Sputter-Beschichtungssystem mit Knopfventil und heben Sie die obere Platte.
5. Legen Sie die getrockneten Proben in der Kammer. Senken Sie die Deckplatte.
6. Schalten Sie den Drehknopf an der Pumpe zu starten Evakuieren der Kammer.
7. Offene Argon Leckventil. Warten Siefür das Vakuum auf 0,05 mbar fallen zu lassen.
8. Bestreichen Sie die getrockneten Proben mit einer dünnen Schicht (0,13 nm) Gold / Palladium.
9. Liefert die Argon Leckventil in seine geschlossene Position.
10. Schalten Sie den Steuerknopf auf aus.
11. Entlüften Sie die Kammer mit Knopfventil und heben Sie die obere Platte.
12. Entfernen Sie die Proben und speichern sie in einem Exsikkator für 24 Stunden.
13. Beachten Sie die Proben unter einem Rasterelektronenmikroskop.

6. Immunfluoreszenzfärbungen

1. Waschen Sie die Zellen (50.000 Zellen / Platte) ausgesät auf der Steuer TCPS und dem PLAGA Gerüst mit PBS 7 Tage im Anschluss an Aussaat.
2. Befestigen Sie die Zellen mit 70% Ethanol (kalt) für 10 min.
3. Die fixierten Zellen bei Raumtemperatur in PBS mit 0,05% Triton X-100 für 20 min inkubieren, mit 1% Rinderserumalbumin (BSA).
4. Tauchen der Proben in 1% Tween bei Raumtemperatur für 20 min.
5. In monoklonalen Maus-Anti-β-Aktin-Antikörper (1:400) und Inkubation der Zellen Overnight bei 4 ° C.
6. Mit 0,05% Tween waschen der Zellen. Hinzufügen sekundärer Antikörper (Ziege-anti-Maus-F (ab ') 2-Fragment von IgG mit einer Fluoreszenzsonde, 1:400 konjugiert) zu den Zellen und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur.
7. Mit dem PBS Waschen Sie die Zellen. Färben der Zellen mit Kernfärbung und montieren mit 80% Glycerin.
8. Beachten Sie die Zellen unter einem konfokalen Mikroskop.

Ergebnisse

Das Arbeitsmodell für die chirurgische Wiederherstellung, Gewebe Verdauung und Isolierung des menschlichen vorderen Kreuzbandes (HACL) abgeleiteten Zellen ist in Abbildung 1 dargestellt. Die aus den Explantaten migriert und an die T-25-Kolben eingehalten Zellen. Diese Zellen wurden für 3 Tage und dann wurden unter einem Lichtmikroskop (2) sichtbar gemacht. Ein Monolayer wurde von Tag 7 erhalten. Die Anwesenheit von gesunden, lebensfähigen Zellen zeigten die erfolgreichen Abruf und Ku...

Diskussion

Das primäre Ziel dieser Studie war hACL/2D Gerüst, um die erhaltenen Zellen in einem Patch zu verwenden, um primäre Reparatur von Teil ACL Tränen zu erweitern. Konservative Behandlung von Teil ACL Tränen kann eine kurze Zeit der Ruhigstellung, Verstrebungen, einer fortschreitenden Sanierungsprogramm und regelmäßige Nachuntersuchungen ^13,16,17 gehören. Doch viele Studien zeigen, dass die konservative Behandlung bei Sportlern hat mit schlechten Ergebnissen und Versagen in Zusammenhang gebracht. Buckley ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Petri-dish	Fisher Scientific	08-757-103C
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994
Collagenase	Gibco	17018-029	Store at 40C
DMEM/F-12	Cellgro	10-092-CV	Store at 40C. Warm in 370C water bath before use.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10082	Store at -800C
Penicillin/Streptomycin	Lonza	17-602E	Store at 40C
Centrifuge Tubes- 15 ml	Corning	430790
T-25 flasks	BD Falcon	3013
Trypsin-Versene mixture	Lonza	17-161E	Store at 40C. Warm in 370C water bath before use.
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100	Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation.
Cryogenic vials	Corning	430489
PLAGA	Purac Biomaterials	Purasorb PLG8523	Store at -800C
TCPS disks	Fisher Scientific	12-545-82
Dichloromethane	Fisher Scientific	AC36423-0010	Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place.
Bytac paper	Saint gobin performance plastics	1420652
Scintillation vial	Fisher Scientific	03-339-21G
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906	Store at 40C
Tween	Fisher Scientific	BP337-500
mouse Anti-β-actin antibody (10 Ab)	Sigma Aldrich	A5441	Store at -200C
goat-anti-mouse antibody (20 Ab)	Cell Signaling	4408	Store at -200C
Hoechst dye	Sigma Aldrich	14530	Store at -200C
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glutaraldehyde	Fisher Scientific	BP2547-1	Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes.
Hexamethyldisilazane	Fisher Scientific	AC43085-1000	Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes.
Sterile Scissors	McKesson	25-716
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Light Microscope	Olympus	CK40
Water Bath	Thermo scientific	2845
Vortex	Labnet	VX-200
Glass Petri plates	fisher Scientific	S31473
Acu-Punch	Acuderm Inc.	P1225	Acu-Punch was used to cut 12mm disks
Cacodylate buffer	Sigma Aldrich	97068	Flammable liquid, carcinogen and irritant.
Osmium tetraoxide	Sigma Aldrich	201030	Highly toxic
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	Harmful if swallowed
Ethanol	Decon Labs	2705	Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition.
General/regional Anesthesia	Amphastar pharmaceuticals		1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance
Antibiotics	Hospira	0409-0805-01	Ancef 1g i.v.
Arthroscopy trocar	Smith and Nephew
Arthroscopy Camera	Smith and Nephew
Arthroscopic grasper and bitter	Arthrex
4.5mm shaver	Arthrex
Interference Screws	Arthrex		stainless steel screws
Sputter Coater	Polaron	E5400