利用荧光蛋白监视非洲锥虫Glycosome动态

摘要

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

摘要

布氏锥虫是一种kinetoplastid寄生虫引起非洲人类锥虫病（HAT），或昏睡病和消耗性疾病，那加那病，牛^1。哺乳动物宿主的血流和采采蝇矢量之间的寄生虫交替。许多细胞器的组合物，以响应这些不同的胞外条件^2-5改变。

Glycosomes是高度专业化的过氧化物酶体中，许多参与糖酵解的酶是条块。在发展和环保监管的方式^4-11 Glycosome成分的变化。目前，用于研究glycosome动力学中最常见的技术是电子和荧光显微镜;技术是昂贵，费时费力，而且不容易适用于高通量分析。

为了克服这些限制，荧光-glycosome报道系统中该增强型黄色荧光蛋白（EYFP）融合于过氧化物酶体靶向序列（PTS2），其引导融合蛋白glycosomes ^12，已经建立。经PTS2eYFP融合蛋白的进口，glycosomes成为荧光。细胞器的降解和回收导致的​​荧光，可以通过流式细胞术测量的损失。大量的细胞（5000个细胞/秒）可在实时无需大量的样品制备待分析诸如固定和装配。这种方法提供了检测响应波动的环境条件变化的细胞器组成的快速路。

引言

布氏锥虫引起非洲昏睡病在人类和一种消耗性疾病，那加那病，牛。在这些疾病的治疗中使用的药物是陈旧的和非常有毒的，疫苗无法提供，并且对于耐药性的发展潜力就必须寻找新的药物靶标^1。

在它的生命周期，T布氏，昆虫载体和哺乳动物宿主之间交替;两台主机，在目前非常不同的环境中的寄生虫必须生存。发生的许多代谢和形态的变化，因为寄生虫暴露于不同的环境条件。其中最显着的变化是单膜界的寄生虫特异性微体观察，称为glycosomes ^13。

血糖水平相对较高（约5毫米）的血液和血液寄生虫（BSF）通过糖酵解WH产生ATP的专ILE线粒体代谢被抑制^14。不像其它真核生物中，糖酵解发生在细胞质中，T.布氏最间隔化的glycosomes ^14,15糖酵解酶。 à吸血过程中的寄生虫就由采采蝇和体验葡萄糖下降，其中下降到检测不到的水平之内被摄入的飞行15分钟。昆虫的新陈代谢，procyclic形式（PCF），寄生虫是更灵活和葡萄糖，以及氨基酸，如脯氨酸，可以在ATP ^16-18的合成中使用。比较蛋白质组学研究揭示生命周期中glycosomal和依赖性变化线粒体蛋白与糖蛋白在血液中的寄生虫增加，参与TCA循环和呼吸链^13,19线粒体蛋白。虽然许多研究都集中在BSF和PCF glycosomes之间的差异，知之甚少发生响应于被膜中的PCF glycosomes的变化ironmental变化。

在苍蝇的肠，血糖水平低，瞬间增加在喂食^20。在大多数在体外研究中，PCF寄生虫生长在含葡萄糖的介质。然而，最近的研究已经表明，在反应显著PCF代谢变化成葡萄糖的可用性^17。在没有葡萄糖，脯氨酸摄取和脯氨酸脱氢酶活性增加了^18。这种变化在线粒体代谢很可能伴随着glycosome组成和形态的变化，但是，这并没有被直接评估。

电子和荧光显微镜是用来共同技术研究glycosome动力学T。布氏 ^2,21-24。这些协议是时间和劳动力密集型的，昂贵的，并且难以适应实时研究和高通量的协议。为了克服这个限制，荧光细胞器报告系统Used来研究哺乳动物和酵母细胞器系统已被修改用于T。布氏 ^12。

荧光的细胞器报告系统已被广泛用于在高等真核生物如酵母，植物和哺乳动物细胞^25-27。在这样的系统中，荧光蛋白融合到靶向蛋白质到特定细胞器的氨基酸序列。靶蛋白的降解或合成是通过荧光测定和改变的细胞器组合物是通过改变细胞的荧光反射。

当增强型黄色荧光蛋白（EYFP）的开放读框融合至II型过氧化物酶体靶向序列（PTS2） ^{如图12所示} ，PTS2eYFP蛋白质导入到成熟，导入感受态glycosomes和荧光可以通过流式细胞仪进行监测。在glycosome组成变化是通过改变细胞的荧光反射。这个系统可以在甲阶辅助咏调控环境引起的变化glycosome组成的机制。

此手稿描述了一种glycosome报告系统在PCF中的寄生虫的产生结合流式细胞术监测活寄生虫实时glycosome动力学，并提供如何被用于跟踪响应于不同的环境变化glycosome组合物的例子。总之，glycosome组合物是由胞外葡萄糖浓度和对数相培养的通路影响到新鲜培养基触发变化glycosome组合物。此系统可以被修改以研究在锥虫及其它寄生虫其它细胞器的动态行为。

研究方案

1，一般锥虫畜牧

1. 称重固体为SDM79媒体制剂（ 表1）。
2. 保存在4℃的50毫升锥形或保鲜袋包。注:本产品保质期至少为6个月。
3. 解冻的胎牛血清（FBS）在37℃水浴，并通过逆周期混合。注:FBS是从供应商的无菌溶液好评。过滤消毒FBS降低其支持寄生虫的生长能力。
4. 一旦整个瓶解冻，热灭活血清30分钟，在56℃水浴，定期搅拌，尽量减少血清成分的沉淀。
5. 解冻青霉素/链霉素溶液（青霉素/链霉素），血红素（2毫克/毫升在50mM的NaOH），并在室温下基本培养基鹰维生素溶液。
6. 到1000量筒，加20.2克SDM79固体（ 表1）的液体成分（ 表2）拌匀上的轰动板。
7. 调节pH至7.35，并带来体积至850毫升的水。
8. 过滤器通过连接真空软管到滤波器瓶底杀菌媒体。施加真空，直到溶液被过滤。
9. 在生物安全柜中取出过滤器上，加入150ml的热灭活胎牛血清。无菌帽和密封介质瓶取下塑料盖。
10. 制备SDM80介质中相同的方式SDM79有以下例外;不添加葡萄糖或葡萄糖，并使用MEM无谷氨酰胺。代替150ml的热灭活的FBS，加入135毫升的渗析，热灭活的FBS，和15毫升的热灭活的胎牛血清。
11. 培养PCF寄生虫中为25cm ²烧瓶中，用10ml合适的培养基中于27℃和5％CO _2。注:细胞应每天使用血细胞计数或流式细胞仪进行计数（参见第6节），并培养物应保持在密度在1×10 ⁵和5×10 ⁶个细胞/ ml。

2，Tr的PCF寄生虫ansfection与荧光记者构造

注:要遵循glycosome动态，含醛缩酶融合，增强黄色荧光蛋白的过氧化物酶体靶向序列（PTS2）记者蛋白表达的寄生虫。该序列编码所述融合蛋白克隆到pXS2bla ^12，其中包含了procyclin子和微管蛋白的基因间区域，其直接同源重组到基因组和杀稻瘟菌素抗性基因用于选择。 Procyclic细胞系携带编码T7聚合酶和四环素阻遏（PF29-13）的基因转化的靶向构建体，pXS2:PTS2eYFP。

1. 通过将表3中所列的组分制备cytomix。筛选在RT消毒和储存。
2. 线性化的质粒DNA用MluI通过吸取10微升的DNA（1微克/微升），5微升限制性内切酶缓冲液，33微升的水，和2μ，L的MluI酶到离心管。在37℃下反应1小时。
3. 纯化的限制，加入1倍体积的结合缓冲液中，以限制性内切酶消化消化。通过涡旋混合的结合缓冲液和消化的DNA。短暂离心所述管的底部以收集样品。
4. 插入DNA结合柱到2 ml收集管中，转移消化的DNA /结合缓冲液列。
5. 离心10,000 xg离心1分钟。离心后，弃去收集管中的滤液和列返回到收集管中。
6. 加入700μl的SPW洗涤缓冲液和离心机以10,000 xg离心1分钟。
7. 从收集管中丢弃滤液，返回列到收集管中，重复SPW洗涤步骤和离心。
8. 丢弃滤液，返回柱到收集管中，并离心3分钟，以10,000 XG空柱以除去残余的乙醇。
9. 在生物安全柜，扔掉COL经文管处列在无菌的离心管。
10. 为了洗脱DNA，加入25微升无菌水至柱并在室温下孵育2分钟。离心机以10,000 xg离心1分钟。
11. 添加另一个25μL无菌水在生物安全罩，以列，在室温下孵育2分钟。
12. 离心机以10,000 XG的速度，持续1分钟。
13. 在生物安全柜的DNA整卷转移到新的无菌离心管中。注:此步骤可以防止污染，从开盖离心过程中。
14. 加入无菌的，纯化的线性化的DNA（10微克），以400微升过滤灭菌cytomix的。
15. 如第6 5×10 ⁷ -10 ^8个细胞在室温描述和收获离心800×g离心15分钟计数细胞。
16. 倒掉上清液，用1毫升血清吸管重悬细胞沉淀在450微升的DNA + cytomix的。
17. 含Ce传输解决方案 LLS，DNA和cytomix在电穿孔室的无菌4毫米间隙比色皿和地方杯中。
18. 选择"指数衰减"，并手动输入以下设置:电压:1.5千伏，容量:25 MF，电阻:Ω，和比色皿:4毫米。按脉搏。一旦脉冲完成后，从电穿孔室中取出试管，返回到生物安全柜中。
19. 到一个新的无菌瓶，吸管10毫升SDM79的。转移转化细胞向烧瓶中，用10ml SDM79的。
20. 培育无药物选择24小时，在_{27℃，5％CO2。} 24小时后，加入G418（15微克/毫升），潮霉素（50微克/毫升），杀稻瘟素（10微克/毫升）。通过1毫升转化细胞与药物进入9毫升SDM79的药物。
21. 如在第6和7。当细胞是荧光描述的，并已达到1×10 ⁷个/ ml的细胞密度每日分析细胞，使stabilates对于长期贮存（3.1-3.3）。

ve_title"> 3。制作Stabilates

1. 使冷冻介质中，添加100％的甘油等体积cytomix和过滤消毒。
2. 加入200μl冷冻介质的800微升细胞（1×10 ^7）在离心管，轻轻混匀，通过反演和放置两个保丽龙架之间，并冻结在-80℃。
3. 一旦冷冻（〜24小时），转移细胞到液氮中。注:移动到细胞_液氮 24小时后，如再储存于-80是很重要℃，导致细胞活力下降。

4，冷冻解冻股

1. 除去从-80冷冻瓶℃并解冻在室温约10分钟。
2. 吸取9毫升SDM79与药物进入一个新的无菌瓶中。添加解冻的细胞以这个烧瓶中。通过将在一个新的烧瓶1ml该培养至9毫升SDM79的（1×10 ⁵个/ ml的终浓度）通过细胞1:10。
3. 在细胞达到10 ⁷ / ml的密度，开始设定仪和稀释试验。

5，流式细胞仪设置

1. 打开流式细胞仪，打开CFLOW Plus计划。注意:在运行任何样品之前，流体应根据步骤5.2-5.7被反和漂洗。
2. 取代，其中所述SIP存储与空管​​超纯水的管。
3. 选择"倒冲"按钮。
4. 一旦反吹完成后，从SIP和丢弃去除微量离心管中。
5. 将载有关于SIP加入1ml新的超纯水一个新的离心管中。
6. 选择新井CFLOW程序。在"运行限制"2分钟的设定时间。在"射流"中选择"快"和"运行"。
7. 一旦2分钟的时限完成后，单击"删除样本数据"按钮。

采用流式细胞仪6细胞计数

1. 与样品代替水来进行计数。设置"运行限制"到30秒，"射流"到"快"，然后选择"运行"。
2. 在30秒的时间限制完成后，CFLOW Plus将提供事件/μL在"上一次运行。"为每一种文化重复计数。注:在细胞达到1×10 ⁷个/ ml，继续稀释法。一个稀释试验完成后电池应停药。细胞更长的时间培养丧失其对环境条件的反应能力。

采用流式细胞仪7测量荧光

1. 为了评估荧光，设置"运行限制"10000事件，"射流"到"慢"。选择"设置门槛"。在"小门槛"，选择"永久取消活动的"，"FSC-H"（在下拉框中），然后输入小于30000。点击"应用"，然后"关闭"。
2. 选择220;直方图"中的新剧情窗口中的一个按钮，然后选择"FSC-A"从下拉列表中，选择"FL1-A"。注:在530纳米波长FL1-A测量荧光。
3. 选择"运行"，然后重复所有文化。
4. 运行通过流体线清洁溶液2分钟，水2分钟。

8稀释测定

1. 通过细胞的1×10 ⁵个细胞/ ml在3ml SDM79的密度的25cm ²培养烧瓶中，并通过后立即，然后在3小时和24小时，测量荧光。

9，数据分析

1. 在CFLOW加选择"分析"选项卡。
2. 点击下的"创建一个新的阴谋。"选择"FSC-A"和一个下拉列表"直方图"按钮就会出现。选择通道"FL1-A"。
3. 突出一个很好分析。选择"门"按钮，手动绘制门感兴趣的人群。
4. 流动Plus将提供电池"伯爵"这个门中和"％的该地块"。

结果

在这个系统中，观察到在glycosome组合物中的葡萄糖依赖性变化。当细胞生长在含葡萄糖的介质，两个总体观察;一个亮点，一个朦胧（ 图2A）。昏暗的细胞怀有不成熟glycosomes，并未进口PTS2eYFP而明亮的细胞怀有成熟和未成熟glycosomes ¹²的混合物。当葡萄糖是存在于所述介质，glycosome蛋白的错误定位是致死^15,28和glycosome蛋白表达可能紧密进口耦合。这种紧密调控负责暗淡的...

讨论

Glycosomes是必不可少的，动态的，寄生虫特异性的细胞器。调节这些细胞器的生物合成，维持，增殖和重塑的过程可能包括可能被利用于治疗目的的药物靶标。尽管潜在的高丰度这样的药物靶点，glycosome生物合成领域已经落后于其它生物体类似过程的研究落后，主要是由于缺乏一个易于处理的，高吞吐量的系统，通过该监测快速，动态的细胞器中的反应在活细胞中。

荧光的细...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A10781	SDM79 Ingredient
L-Alanine	Avocado Research Chemicals Ltd	A15804	SDM79 Ingredient
L-Arginine	CalBiochem	1820	SDM79 Ingredient
p-Aminobenzoic acid	ICN Biomedicals	102569	SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)	Sigma	B6891	SDM79 Ingredient
Biotin	Fisher	BP232-1	SDM79 Ingredient
Calcium chloride	VWR	BDH0224	Cytomix
EDTA	Fisher	S311-100	Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit	Omega Biotek	D2500-01	DNA purifiation
Research grade Serum	Fisher	03-600-511	SDM79 Ingredient
Folic acid	ICN Biomedicals	101725	SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl	ICN Biomedicals	194671	SDM79 Ingredient
Glucose	GIBCO	15023-021	SDM79 Ingredient
L-Glutamine	CalBiochem	3520	SDM79 Ingredient
Glycerol	Acros Organics	Ac15892-0010	Freezing media
Graces insect cell media powder	GIBCO	11300-043	SDM79 Ingredient
Hemin	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Guanosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A11328	SDM79 Ingredient
HEPES	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Magnesium chloride	Fisher	BP214-500	Cytomix ingredient
L-Methionine	Fisher	BP388-100	SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50x)	Cellgro	25-030-CI	SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100x)	Lonza	13-114E	SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine	Cellgro	10-010-CM	SDM79 Ingredient
MOPS	Fisher	BP308-500	SDM79 Ingredient
Sodium biocarbonate	Fisher	S233-500	SDM79 Ingredient
Penicillin-streptomycin Solution	Cellgro	30-002-CI	SDM79 Ingredient
L-Phenylalanine	ICN Biomedicals	102623	SDM79 Ingredient
Potassium chloride	Fisher	P217-500	Cytomix ingredient
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Fisheer	P290-212	Cytomix ingredient
L-Proline	Fisher	BP392-100	SDM79 Ingredient
L-Serine	Acros Organics	56-45-1	SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt	Acros Organics	113-24-6	SDM79 Ingredient
L-Taurine	TCI America	A0295	SDM79 Ingredient
L-Threonine	Acros Organics	72-19-5	SDM79 Ingredient
L-Tyrosine	ICN Biomedicals	103183	SDM79 Ingredient
E.Z.N.A. Cycle Pure kit	Omega Biotek	D6492-02	DNA purification
Binding buffer	Omega Biotek	PDR041	DNA purification
SPW wash buffer	Omega Biotek	PDR045	DNA purification
Gene Pulser Xcell	Biorad	165-2660	Trypanosome transformation
4 mm Electroporation cuvettes	VWR		Trypanosome transformation