Utilisation de protéines fluorescentes pour surveiller glycosome Dynamics dans le trypanosome africain

Résumé

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Résumé

Trypanosoma brucei est un parasite qui provoque kinétoplastide la trypanosomiase humaine africaine (THA) ou maladie du sommeil, et une maladie débilitante, nagana, chez les bovins ^1. Les parasite alterne entre la circulation sanguine de l'hôte mammifère et le vecteur de mouche tsé-tsé. La composition de nombreux organites cellulaires change en réponse à ces différentes conditions extracellulaires ^5.2.

Glycosomes sont peroxysomes hautement spécialisées dans laquelle beaucoup des enzymes impliquées dans la glycolyse sont compartimentés. Changements dans la composition glycosome d'une manière intellectuelle et ICPE ^4-11. Actuellement, les techniques les plus couramment utilisées pour étudier la dynamique glycosome sont la microscopie électronique et fluorescence; techniques qui coûtent cher, de temps et de main-d'œuvre, et pas facilement adapté à l'analyse à haut débit.

Pour surmonter ces limitations, un système rapporteur fluorescent dans glycosomece qui a renforcé la protéine fluorescente jaune (EYFP) est fusionnée à une séquence de ciblage de peroxysome (PTS2), qui dirige la protéine de fusion à glycosomes ^12, a été établi. Lors de l'importation de la protéine de fusion PTS2eYFP, glycosomes deviennent fluorescentes. la dégradation des organites et le recyclage entraîne la perte de la fluorescence qui peut être mesuré par cytométrie de flux. Un grand nombre de cellules (5000 cellules / sec) peuvent être analysées en temps réel avec une préparation de l'échantillon tel que la fixation et le montage. Ce procédé offre un moyen rapide de détection de changements dans la composition d'un organite, en réponse aux fluctuations des conditions ambiantes.

Introduction

Trypanosoma brucei cause la maladie du sommeil en Afrique chez les humains et une maladie débilitante, nagana, chez les bovins. Médicaments utilisés dans le traitement de ces maladies sont vétustes et très toxique, les vaccins ne sont pas disponibles, et le potentiel pour le développement de la résistance aux médicaments nécessitent la recherche de nouvelles cibles de médicaments ^1.

Au cours de son cycle de vie, T. brucei, alterne entre un insecte vecteur et hôte mammifère; deux hôtes qui présentent des environnements très différents dans lesquels le parasite doit survivre. Un certain nombre de changements métaboliques et morphologiques se produisent comme le parasite est exposé à des conditions environnementales différentes. Certains des changements les plus importants sont observés dans microbodies spécifiques parasites seule membrane délimitée, appelé glycosomes ^13.

Les niveaux de glucose sont relativement élevés (~ 5 mM) dans le sang et la circulation sanguine des parasites (BSF) génèrent ATP exclusivement par wh de la glycolysemétabolisme mitochondrial ile est réprimée ^14. Contrairement à d'autres eucaryotes dans laquelle se produit la glycolyse dans le cytoplasme, T. brucei compartimente la plupart des enzymes de la glycolyse dans glycosomes ^14,15. Les parasites sont prises par la mouche tsé-tsé au cours d'un repas de sang et connaissent une baisse de la glycémie, qui tombe à des niveaux indétectables dans les 15 minutes d'être ingéré par la mouche. Le métabolisme de l'insecte, de la forme procyclique (PCF), parasites est plus souple et de glucose, ainsi que des acides aminés tels que la proline, peuvent être utilisés dans la synthèse de l'ATP ^{de 16 à 18.} Études protéomiques comparatives révèlent les changements du cycle de vie dépendent en glycosomale et protéines mitochondriales avec des protéines glycolytiques augmentation dans la circulation sanguine des parasites et des protéines mitochondriales impliquées dans le cycle de Krebs et la chaîne respiratoire ^13,19. Alors que de nombreuses études ont porté sur les différences entre BSF et glycosomes PCF, on sait peu sur les changements dans glycosomes PCF qui se produisent en réponse à envchangements ironmental.

Dans le gros intestin de la mouche, les niveaux de glucose sont faibles à des augmentations transitoires au cours d'une alimentation ^20. Dans la plupart des études in vitro, les parasites PCF sont cultivées dans des milieux contenant du glucose. Cependant, des études récentes ont démontré que les changements du métabolisme PCF significativement en réponse au glucose disponibilité ^17. En l'absence de glucose, la proline et la proline absorption augmentation de l'activité déshydrogénase ^18. Ce changement dans le métabolisme mitochondrial est probablement accompagnée par un changement de la composition et de la morphologie de glycosome, cependant, ceci n'a pas été directement évalué.

Microscopie électronique et de fluorescence sont des techniques courantes utilisées pour étudier la dynamique de glycosome en T. brucei ^2,21-24. Ces protocoles sont le temps et de main-d'œuvre, coûteux et difficiles à adapter aux études en temps réel et des protocoles à haut débit. Pour surmonter cette limitation, un système rapporteur fluorescent u-organitesed pour étudier organites dans les systèmes de mammifères et de levure a été modifié pour une utilisation dans T. brucei ^12.

Systèmes rapporteurs fluorescents-organelles ont été largement utilisés dans des eucaryotes supérieurs tels que des levures, des plantes, des cellules de mammifères et ^{de 25 à 27.} Dans de tels systèmes, une protéine fluorescente est fusionnée à une séquence d'acides aminés qui cible la protéine à des organites spécifiques. La dégradation ou la synthèse des protéines cibles est mesurée par fluorescence et des changements dans la composition des organites sont reflétés par des changements dans la fluorescence de la cellule.

Lorsque le cadre du renforcement de la protéine fluorescente jaune (EYFP) de lecture ouvert est fusionnée à une séquence de type II de ciblage des peroxysomes (PTS2) ^12, la protéine PTS2eYFP est importé dans glycosomes matures, importation compétent et de la fluorescence peut être contrôlé par cytométrie de flux. Les variations de composition glycosome se traduisent par des changements dans la fluorescence cellulaire. Ce système peut aider à résolVing les mécanismes qui régulent les changements induits par l'environnement dans glycosome composition.

Ce manuscrit décrit la génération d'un système glycosome rapporteur dans parasites PCF en collaboration avec la cytométrie de flux pour suivre la dynamique de glycosome en temps réel à des parasites vivants et fournit un exemple de la façon dont il a été utilisé pour suivre l'évolution de glycosome composition en réponse à des environnements différents. En résumé, glycosome composition est influencée par les concentrations de glucose extracellulaire et le passage des cultures en phase logarithmique dans un milieu frais déclenche des changements dans glycosome composition. Ce système peut être modifié pour étudier le comportement dynamique des autres organites dans les trypanosomes et les autres parasites.

Protocole

1. général trypanosomes élevage

1. Peser les solides pour la préparation de milieux SDM79 (tableau 1).
2. Conserver à 4 ° C dans 50 ml conique ou un sac Ziploc. REMARQUE: Les réactifs sont stables pendant au moins 6 mois.
3. Dégel du sérum de veau fœtal (FBS) dans un bain-marie à 37 °, et mélanger périodiquement par inversion. REMARQUE: FBS est reçue par le fournisseur comme une solution stérile. Filtre stérilisant FBS réduit sa capacité à soutenir la croissance du parasite.
4. Une fois que la totalité du flacon est décongelé, la chaleur inactiver le sérum pendant 30 min dans un bain-marie à 56 ° C, en mélangeant périodiquement afin de minimiser la précipitation des composants du sérum.
5. Pénicilline dégel / solution de streptomycine (stylo / angine), hémine (2 mg / ml dans du NaOH 50 mM), et la solution aigle de vitamine milieu de base à la température ambiante.
6. Pour 1.000 ml graduée, ajouter 20,2 g de matières solides SDM79 (tableau 1) aux composants liquides (tableau 2) et bien mélanger sur une plaque d'agitation.
7. Ajuster le pH à 7,35, et porter le volume à 850 ml avec de l'eau.
8. Stériliser par filtration support par la fixation d'un tuyau d'aspiration sur le fond d'une bouteille de filtre. Appliquer le vide jusqu'à ce que la solution est filtrée.
9. Retirer la partie supérieure du filtre dans l'enceinte de sécurité biologique et ajouter 150 ml d'inactivé par la chaleur de FBS. Enlevez le couvercle de plastique du bouchon stérile et une bouteille de médias d'étanchéité.
10. Préparer SDM80 support de la même manière que SDM79 avec les exceptions suivantes; ne pas ajouter de glucose ou de la glucosamine et utiliser MEM sans glutamine. A la place de 150 ml de FBS inactivé par la chaleur, ajouter 135 ml de dialyse, de la chaleur de FBS inactivé, et 15 ml de FBS inactivé par la chaleur.
11. Culture parasites PCF en flacon de 25 ^cm2 avec 10 ml de milieu approprié à 27 ° C et 5% de CO _2. NOTE: Les cellules doivent être comptabilisés quotidiennement en utilisant un hématimètre ou un cytomètre de flux (voir la section 6) et cultures doivent être maintenues à des densités entre 1 x 10 ⁵ et ⁵ x 10 ⁶ cellules / ml.

2 Transfection de PCF parasites avec la construction de rapporteur fluorescent

NOTE: Pour suivre glycosome dynamique, une protéine rapporteur contenant la séquence de ciblage des peroxysomes (PTS2) de aldolase fusionnée à la protéine fluorescente jaune améliorée est exprimée dans les parasites. La séquence codant pour la protéine de fusion est clone dans pXS2bla ^12, qui contient le promoteur de procycline et les régions intergéniques tubuline, qui recombinaison homologue dans le génome directe et le gène de résistance à la blasticidine de sélection. Lignées cellulaires hébergeant procyclique les gènes codant pour la polymerase T7 et répresseur tetracycline (PF29-13) sont transformées avec la construction de ciblage, pXS2: PTS2eYFP.

1. Préparer CYTOMIX en mélangeant les composants répertoriés dans le tableau 3. Filtre stériliser et conserver à la température ambiante.
2. Linéarisation de l'ADN de plasmide avec Mlul par pipetage de 10 ul de l'ADN (1 ug / ul), le tampon d'enzyme de restriction de 5 pi, 33 pi d'eau, et 2 μ; L de MluI enzyme dans un tube à centrifuger. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
3. Purifier la digestion de restriction en ajoutant 1 volume de tampon de liaison à l'enzyme de digestion de restriction. Mélanger tampon de liaison et l'ADN digéré par vortex. Centrifuger brièvement pour collecter l'échantillon au fond du tube.
4. Insérer une colonne dans un tube de liaison 2 ml de collecte d'ADN, et le transfert de l'ADN digéré / solution tampon de liaison à la colonne.
5. Centrifuger 10 000 g pendant 1 min. Après centrifugation, éliminer le filtrat de tube de collecte et de retour à la colonne du tube de collecte.
6. Ajouter 700 ul de tampon de lavage SPW et centrifuger à 10 000 g pendant 1 min.
7. Jeter le filtrat à partir de tube de collecte, de retour à la colonne du tube de collecte et répéter SPW étape de lavage et centrifugation.
8. Filtrat Jeter, colonne de retour au tube de collecte, et centrifugeuse colonne vide pendant 3 min à 10 000 xg pour éliminer l'éthanol résiduel.
9. Dans une enceinte de sécurité biologique, jeter coltube de collecte et lieu colonne dans un tube à centrifuger stérile.
10. Pour éluer l'ADN, ajouter 25 ul d'eau stérile à la colonne et incuber à température ambiante pendant 2 min. Centrifuger à 10 000 g pendant 1 min.
11. Ajouter un autre 25 pi d'eau stérile dans la hotte de biosécurité à la colonne et incuber à température ambiante pendant 2 min.
12. Centrifuger à 10000 vitesse de g pendant 1 min.
13. Dans une enceinte de biosécurité transférer tout le volume de l'ADN à un nouveau tube stérile. REMARQUE: Cette étape empêche la contamination par le couvercle ouvert pendant la centrifugation.
14. Ajouter l', purifié, de l'ADN linéarisé stérile (10 mg) à 400 ul de CYTOMIX stérilisée par filtration.
15. Compter les cellules comme décrit dans l'article 6 et récolter 5 x10 ⁷ -10 ⁸ cellules par centrifugation à 800 g pendant 15 min à température ambiante.
16. Décanter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 450 pi d'ADN + CYTOMIX utilisant une pipette sérologique de 1 ml.
17. la solution de transfert contenant CE lls, ADN, et CYTOMIX à un écart de 4 mm cuvette et le lieu cuvette stérile dans la chambre d'électroporation.
18. Sélectionnez «Décroissance exponentielle" et entrer manuellement les paramètres suivants: tension: 1,5 kV, Capacité: 25 mF, Résistance: Ω, et de la Cuvette: 4 mm. impulsion de presse. Une fois que l'impulsion est terminée, retirez la cuvette de la chambre d'électroporation et revenir à l'enceinte de sécurité biologique.
19. Dans un nouveau flacon stérile, une pipette 10 ml de SDM79. Transférer les cellules transformées dans le ballon avec 10 ml de SDM79.
20. Incuber sans sélection de médicaments pendant 24 heures à 27 ° C, 5% CO _2. Après 24 heures, ajouter du G418 (15 ug / ml), l'hygromycine (50 mg / ml), et de la blasticidine (10 ug / ml). Passez 1 ml de cellules transformées avec le médicament dans 9 ml de SDM79 avec la drogue.
21. Analyser les cellules quotidienne comme décrit dans les sections 6 et 7 Lorsque les cellules sont fluorescentes, et ont atteint une densité cellulaire de 1 x 10 ⁷ / ml, faire stabilats pour le stockage à long terme (3.1-3.3).

ve_title "> 3. Faire stabilats

1. Pour faire des milieux de congélation, ajouter un volume égal à 100% de glycérol à CYTOMIX et filtre stériliser.
2. Ajouter 200 ul de milieu de congélation de 800 pi de cellules (1 x 10 ⁷⁾ dans un tube cryogénique, mélanger doucement par inversion et entre deux supports en polystyrène et congeler à -80 ° C.
3. Une fois congelés (~ 24 h), les cellules de transfert à l'azote liquide. NOTE: Il est important de déplacer des cellules dans LN ₂ après 24 h, comme plus de stockage à -80 ° C conduit à une diminution de la viabilité cellulaire.

4. stocks dégel congelés

1. Retirer flacon congelé entre -80 ° C et décongélation à température ambiante pendant environ 10 min.
2. Pipette 9 ml de SDM79 avec la drogue dans un nouveau flacon stérile. Ajouter cellules décongelées à ce flacon. Faire passer les cellules 01 heures 10 en ajoutant 1 ml de cette culture à 9 ml de SDM79 dans un nouveau flacon (concentration finale de 1 x 10 ⁵ / ml).
3. Avant que les cellules atteignent une densité de 10 ⁷ / ml, commencer cytomètre mettreet des dosages de dilution.

5. configuration du cytomètre

1. Allumez le cytomètre en flux et ouvrir programme cflow Plus. REMARQUE: Avant d'effectuer des échantillons, la fluidique devraient être rincé et rincés selon les étapes 5.2 à 5.7.
2. Remplacer le tube d'eau nanopure dans lequel la gorgée est enregistrée avec un tube vide.
3. Sélectionnez le bouton "backflush".
4. Une fois backflush est terminée, retirez tube de l'gorgée et défausse.
5. Placez un nouveau tube contenant 1 ml d'eau nouvelle nanopure sur la gorgée.
6. Sélectionnez un nouveau puits dans le programme cflow. Sous la rubrique «Limites Run" régler le temps pendant 2 min. Sous la rubrique «fluidique», sélectionnez «rapide» et «Run».
7. Une fois le délai de 2 min est terminée, cliquez sur le bouton "Supprimer des exemples de données".

6 Comptage des cellules en utilisant le cytomètre de flux

1. Remplacer l'eau par l'échantillon à être compté. Set "Limites Exécuter "pour 30 secondes," Fluidics "à" rapide "puis sélectionnez" Exécuter ".
2. Après le délai de 30 secondes est terminée, cflow ainsi fournira les événements / ul sous "Last Run." Répétez comptage pour chaque culture. REMARQUE: Avant de cellules atteignent 1 x 10 ⁷ cellules / ml, procéder à essai de dilution. Les cellules doivent être interrompues après un essai de dilution est terminée. Les cellules en culture pendant de plus longues périodes perdent leur capacité à répondre à des conditions environnementales.

7. fluorescence de mesure utilisant le cytomètre de flux

1. Pour évaluer la fluorescence, réglez «Limites Run" à 10.000 événements, et «fluidique» à «ralentir». Sélectionnez «seuil Set". Sous "Seuil primaire", sélectionnez "éliminer de manière permanente les événements sur», «FSC-H" (dans menu déroulant) et entrez moins de 30.000. Cliquez sur "Appliquer", puis "close".
2. Sélectionnez l'220; "dans une des nouvelles fenêtres de tracé et sélectionnez" histogramme FSC-A "De la liste déroulante, sélectionnez" FL1-A ". REMARQUE: mesures FL1-A fluorescence dans la longueur d'onde de 530 nm.
3. Sélectionnez "Exécuter" et répétez l'opération pour toutes les cultures.
4. Exécuter solution de nettoyage à travers la ligne fluidique pendant 2 min et de l'eau pendant 2 min.

8. dilution dosages

1. Passez cellules à une densité de 1 x 10 ⁵ cellules / ml dans 3 ml de SDM79 en 25 cm ballon de ² culture et de mesurer floraison immédiatement après le passage, puis à 3 h et 24 h.

Analyse 9. données

1. Sélectionnez "Analyser" onglet sur cflow Plus.
2. Cliquez sur le bouton "Histogramme" sous "Faire une nouvelle parcelle." Sélectionner "FSC-A" et une liste de menu déroulant apparaîtra. Sélectionnez le canal "FL1-A."
3. Mettez en surbrillance un puits à analyser. Sélectionnez le bouton "Gate", et d'en tirer manuellement une vannepour la population d'intérêt.
4. Flow Plus fournira cellule "comte" dans cette porte et "% de ce complot".

Résultats

Dans ce système, un changement dépendant du glucose dans glycosome composition a été observée. Lorsque les cellules sont cultivées dans des milieux contenant du glucose, deux populations sont observés; un brillant et un faible (figure 2A). Cellules sombres abritent glycosomes immatures, qui ne sont pas importés du PTS2eYFP tandis que les cellules lumineuses abritent un mélange de glycosomes matures et immatures ^12. Lorsque le glucose est présent dans les médias, mauvaise localisati...

Discussion

Glycosomes sont des organites essentiels, dynamiques, spécifiques du parasite. Les processus qui régissent la biogenèse, la maintenance, la prolifération et le remodelage de ces organites sont probablement des cibles de médicaments qui pourraient être exploitées à des fins thérapeutiques. Malgré potentiellement forte abondance de ces cibles de médicaments, le domaine de la glycosome biogenèse a pris du retard l'étude des processus similaires dans d'autres organismes, principalement en raison de l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A10781	SDM79 Ingredient
L-Alanine	Avocado Research Chemicals Ltd	A15804	SDM79 Ingredient
L-Arginine	CalBiochem	1820	SDM79 Ingredient
p-Aminobenzoic acid	ICN Biomedicals	102569	SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)	Sigma	B6891	SDM79 Ingredient
Biotin	Fisher	BP232-1	SDM79 Ingredient
Calcium chloride	VWR	BDH0224	Cytomix
EDTA	Fisher	S311-100	Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit	Omega Biotek	D2500-01	DNA purifiation
Research grade Serum	Fisher	03-600-511	SDM79 Ingredient
Folic acid	ICN Biomedicals	101725	SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl	ICN Biomedicals	194671	SDM79 Ingredient
Glucose	GIBCO	15023-021	SDM79 Ingredient
L-Glutamine	CalBiochem	3520	SDM79 Ingredient
Glycerol	Acros Organics	Ac15892-0010	Freezing media
Graces insect cell media powder	GIBCO	11300-043	SDM79 Ingredient
Hemin	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Guanosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A11328	SDM79 Ingredient
HEPES	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Magnesium chloride	Fisher	BP214-500	Cytomix ingredient
L-Methionine	Fisher	BP388-100	SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50x)	Cellgro	25-030-CI	SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100x)	Lonza	13-114E	SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine	Cellgro	10-010-CM	SDM79 Ingredient
MOPS	Fisher	BP308-500	SDM79 Ingredient
Sodium biocarbonate	Fisher	S233-500	SDM79 Ingredient
Penicillin-streptomycin Solution	Cellgro	30-002-CI	SDM79 Ingredient
L-Phenylalanine	ICN Biomedicals	102623	SDM79 Ingredient
Potassium chloride	Fisher	P217-500	Cytomix ingredient
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Fisheer	P290-212	Cytomix ingredient
L-Proline	Fisher	BP392-100	SDM79 Ingredient
L-Serine	Acros Organics	56-45-1	SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt	Acros Organics	113-24-6	SDM79 Ingredient
L-Taurine	TCI America	A0295	SDM79 Ingredient
L-Threonine	Acros Organics	72-19-5	SDM79 Ingredient
L-Tyrosine	ICN Biomedicals	103183	SDM79 Ingredient
E.Z.N.A. Cycle Pure kit	Omega Biotek	D6492-02	DNA purification
Binding buffer	Omega Biotek	PDR041	DNA purification
SPW wash buffer	Omega Biotek	PDR045	DNA purification
Gene Pulser Xcell	Biorad	165-2660	Trypanosome transformation
4 mm Electroporation cuvettes	VWR		Trypanosome transformation