Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per monitorare Glycosome Dynamics in Tripanosoma africano

Riepilogo

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Abstract

Trypanosoma brucei è un parassita che causa kinetoplastidi tripanosomiasi umana africana (HAT), o malattia del sonno, e una malattia devastante, nagana, nei bovini ^1. I supplenti parassita tra il sangue del mammifero ospite e la mosca tse-tse vettore. La composizione di molti organelli cellulari cambia in risposta a queste differenti condizioni extracellulari ^2-5.

Glycosomes perossisomi sono altamente specializzati in cui molti degli enzimi coinvolti nella glicolisi sono compartimenti stagni. Composizione cambia Glycosome in maniera evolutiva e regolamentato l'ambiente ^4-11. Attualmente, le tecniche più comuni utilizzate per studiare glycosome dinamiche sono elettroni e microscopia a fluorescenza; tecniche che sono costosi, tempo e lavoro, e non facilmente adattato alle analisi di throughput elevato.

Per superare queste limitazioni, un sistema reporter fluorescente-glycosome inche migliorato proteina fluorescente gialla (EYFP) si fonde a una sequenza di targeting dei perossisomi (PTS2), che dirige la proteina di fusione per glycosomes ^12, è stato istituito. Con l'importazione della proteina di fusione PTS2eYFP, glycosomes diventano fluorescenti. Degrado organello e risultati riciclaggio nella perdita di fluorescenza che può essere misurato mediante citometria a flusso. Un gran numero di cellule (5.000 cellule / sec) possono essere analizzati in tempo reale senza una preparazione del campione come la fissazione e il montaggio. Questo metodo offre un modo rapido di rilevare cambiamenti nella composizione organello in risposta alle mutevoli condizioni ambientali.

Introduzione

Trypanosoma brucei causa la malattia africana sonno negli esseri umani e una malattia devastante, nagana, nei bovini. Farmaci utilizzati nel trattamento di queste malattie sono antiquate ed estremamente tossico, i vaccini non sono disponibili, e il potenziale di sviluppo di resistenza ai farmaci richieda l'ricerca di nuovi bersagli farmacologici ^1.

Durante il suo ciclo di vita, T. brucei, si alterna tra un insetto vettore e ospite mammiferi; due host che presentano molto diversi ambienti in cui il parassita deve sopravvivere. Una serie di cambiamenti metabolici e morfologici si verificano come il parassita è esposto a diverse condizioni ambientali. Alcuni dei cambiamenti più drammatici sono stati osservati in parassiti microcorpi specifici-single-membrana delimitata, chiamato glycosomes ^13.

I livelli di glucosio sono relativamente alti (~ 5 mm) nel sangue e parassiti del sangue (BSF) generano ATP esclusivamente attraverso wh glicolisimetabolismo mitocondriale ile è represso ^14. A differenza di altri eucarioti in cui glicolisi avviene nel citoplasma, T. brucei compartimentalizza maggior parte degli enzimi glicolitici in glycosomes ^14,15. I parassiti sono prese dalla mosca tse-tse durante un farine e sperimentare un calo di glucosio, che scende a livelli non rilevabili entro 15 min di essere ingerito dalla mosca. Il metabolismo di insetti, forma prociclico (PCF), parassiti è più flessibile e glucosio, nonché aminoacidi come prolina, possono essere utilizzati nella sintesi di ATP ^16-18. Studi di proteomica comparativi rivelano ciclo di vita variazioni dipendenti in glycosomal e proteine ​​mitocondriali con le proteine ​​glicolitici aumentato in parassiti del sangue e proteine ​​mitocondriali coinvolte nel ciclo TCA e catena respiratoria ^13,19. Mentre molti studi si sono concentrati sulle differenze tra BSF e glycosomes PCF, poco si sa circa i cambiamenti in glycosomes PCF che si verificano in risposta a envmodifiche ironmental.

Nel hindgut della mosca, i livelli di glucosio sono bassi con aumenti transitori nel corso di una alimentazione ^20. In più studi in vitro, i parassiti PCF vengono coltivate in terreni contenenti glucosio. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che i cambiamenti del metabolismo PCF significativamente in risposta al glucosio disponibilità ^17. In assenza di glucosio, prolina captazione e prolina aumento deidrogenasi ^18. Questo cambiamento nel metabolismo mitocondriale è probabilmente accompagnato da un cambiamento nella composizione glycosome e morfologia, tuttavia, questo non è stato valutato direttamente.

Elettroni e microscopia a fluorescenza sono comuni tecniche utilizzate per studiare le dinamiche glycosome in T. brucei ^2,21-24. Questi protocolli sono tempo e lavoro, costoso e difficile adattarsi agli studi in tempo reale e protocolli ad alto rendimento. Per superare questa limitazione, un sistema reporter fluorescente-organello used per studiare organelli nei sistemi di mammiferi e di lievito è stata modificata per l'uso in T. brucei ^12.

Sistemi reporter fluorescente-organelli sono stati ampiamente utilizzati in eucarioti superiori come il lievito, piante e cellule di mammifero ^25-27. In tali sistemi, una proteina fluorescente è fuso ad una sequenza di amminoacidi che ha come bersaglio la proteina di organelli specifici. La degradazione o la sintesi delle proteine ​​target viene misurata tramite fluorescenza e cambiamenti nella composizione organelli sono riflesse dai cambiamenti nella fluorescenza delle cellule.

Quando la cornice di lettura aperta della proteina fluorescente gialla maggiore (EYFP) è fusa ad un perossisomica sequenza di targeting di tipo II (PTS2) ^12, la proteina PTS2eYFP viene importato in, glycosomes e fluorescenza di importazione-competente maturi può essere monitorato tramite citometria a flusso. Variazioni nella composizione glycosome sono riflesse dai cambiamenti nella fluorescenza cellulare. Questo sistema può aiutare a risolVing i meccanismi che regolano i cambiamenti provocati dall'ambiente in glycosome composizione.

Questo manoscritto descrive la generazione di un sistema glycosome giornalista in parassiti PCF in collaborazione con citometria a flusso per monitorare le dinamiche glycosome in tempo reale in parassiti vivi e fornisce un esempio di come è stato utilizzato per seguire cambiamenti nella composizione glycosome in risposta a diversi ambienti. In sintesi, glycosome composizione è influenzata dalla concentrazione di glucosio extracellulare e passaggio di culture log-fase in mezzi freschi innesca cambiamenti nella glycosome composizione. Questo sistema può essere modificato per studiare il comportamento dinamico di altri organelli in tripanosomi e altri parassiti.

Protocollo

1. Generale Tripanosoma Zootecnica

1. Pesare solidi per SDM79 preparazione supporti (Tabella 1).
2. Conservare a 4 ° C in 50 ml conica o un sacchetto a chiusura ermetica. NOTA: I reagenti sono stabili per almeno 6 mesi.
3. Scongelare siero fetale bovino (FBS) in un bagnomaria a 37 ° C, e mescolare periodicamente per inversione. NOTA: FBS viene ricevuto dal fornitore come una soluzione sterile. Filtro sterilizzante FBS riduce la sua capacità di sostenere la crescita del parassita.
4. Una volta che l'intera bottiglia è scongelato, il calore inattivare il siero per 30 minuti in un bagnomaria a 56 ° C, mescolando periodicamente per ridurre al minimo la precipitazione di componenti del siero.
5. Thaw penicillina / streptomicina soluzione (pen / strep), emina (2 mg / ml in NaOH 50 mM), e la soluzione a medio basale aquila vitamina a temperatura ambiente.
6. Per 1.000 ml cilindro graduato, aggiungere 20,2 g di solidi SDM79 (Tabella 1) ai componenti liquidi (Tabella 2) e mescolare bene su un piatto mescolare.
7. Regolare il pH a 7,35, e portare il volume a 850 ml con acqua.
8. Filtro sterilizzare supporti collegando un tubo di aspirazione sul fondo di una bottiglia filtro. Applicare vuoto finché la soluzione viene filtrata.
9. Rimuovere il filtro in alto nell'armadio biosicurezza e aggiungere 150 ml di FBS inattivato al calore. Rimuovere rivestimento in plastica dal tappo sterile e bottiglia mezzi di tenuta.
10. Preparare supporti SDM80 nello stesso modo come SDM79 con le seguenti eccezioni; non aggiungere il glucosio o glucosamina e utilizzare MEM, senza glutammina. Al posto di 150 ml di FBS inattivato al calore, aggiungere 135 ml di dializzato, FBS inattivato al calore, e 15 ml di FBS inattivato al calore.
11. Cultura PCF parassiti a 25 centimetri pallone ² con 10 ml di mezzo appropriato a 27 ° C e 5% di CO _2. NOTA: Le cellule devono essere conteggiati tutti i giorni con un emocitometro o un citofluorimetro (vedi paragrafo 6) e le colture devono essere mantenute a densità tra 1 x 10 ⁵ e 5 x 10 ⁶ cellule / ml.

2 Transfection di PCF parassiti con il Reporter Construct fluorescente

NOTA: Per seguire glycosome dinamica, una proteina reporter contenente la sequenza di targeting dei perossisomi (PTS2) di aldolasi fusa alla proteina fluorescente gialla maggiore è espressa nei parassiti. La sequenza codificante la proteina di fusione viene clonato in pXS2bla ^12, che contiene il promotore procyclin e le regioni intergeniche tubulina, che ricombinazione omologa diretto nel genoma e il gene di resistenza blasticidin per la selezione. Linee cellulari prociclico che ospitano i geni che codificano la polimerasi e tetraciclina repressore T7 (PF29-13) vengono trasformate con il costrutto di targeting, pXS2: PTS2eYFP.

1. Preparare cytomix miscelando i componenti elencati nella Tabella 3. Filtro sterilizzare e conservare a temperatura ambiente.
2. Linearizza DNA plasmidico con MluI pipettando 10 ml di DNA (1 mg / mL), 5 ml di buffer enzima di restrizione, acqua 33 ml, e 2 μ; L di MluI enzima in una provetta. Incubare a 37 ° C per 1 ora.
3. Purificare la restrizione digerire con l'aggiunta di 1 volume di tampone di legame per l'enzima di restrizione digest. Mescolare binding buffer e DNA digerito con il vortex. Brevemente centrifugare per raccogliere il campione al fondo della provetta.
4. Inserire una colonna vincolante in un tubo di raccolta da 2 ml DNA, e il trasferimento di DNA digerito / soluzione tampone a colonna vincolante.
5. Centrifugare per 10.000 xg per 1 minuto. Dopo centrifugazione, scartare filtrato dal tubo di raccolta e riportare la colonna al tubo di raccolta.
6. Aggiungere 700 ml di SPW tampone di lavaggio e centrifugare a 10.000 xg per 1 min.
7. Scarta filtrato dal tubo di raccolta, riportare la colonna al tubo di raccolta e ripetere SPW fase di lavaggio e centrifugazione.
8. Eliminare filtrato, il ritorno colonna di tubo di raccolta, e centrifugare colonna vuota per 3 min a 10.000 xg per rimuovere l'etanolo residuo.
9. In un armadio biosicurezza, buttare via coltubo colta e colonna posto in una provetta sterile.
10. Per eluire il DNA, aggiungere 25 ml di acqua sterile per colonna e incubare a temperatura ambiente per 2 min. Centrifugare a 10.000 xg per 1 min.
11. Aggiungere altri 25 ml di acqua sterile in cappa di biosicurezza a colonna e incubare a temperatura ambiente per 2 min.
12. Centrifugare a 10.000 xg velocità per 1 min.
13. In un armadio biosicurezza trasferire intero volume di DNA in una nuova provetta sterile. NOTA: Questo passaggio impedisce la contaminazione dal coperchio aperto durante la centrifugazione.
14. Aggiungere la sterile, purificato, DNA linearizzato (10 mg) per 400 ml di cytomix sterilizzata per filtrazione.
15. Contare le celle come descritto nella sezione 6 e raccogliere 5 x10 ⁷ -10 ⁸ cellule per centrifugazione a 800 xg per 15 minuti a temperatura ambiente.
16. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 450 ml di DNA + cytomix con una pipetta 1 ml sierologica.
17. Trasferire la soluzione contenente ce LLS, DNA, e cytomix ad una sterile 4 millimetri divario cuvetta e posto cuvetta nella camera di elettroporazione.
18. Selezionare "decadimento esponenziale" e immettere manualmente le seguenti impostazioni: Tensione: 1.5 kV, Capacità: 25 mF, Resistance: Ω, e Cuvette: 4 mm. Premere impulso. Una volta che il polso, rimuovere cuvetta dalla camera di elettroporazione e tornare al mobile biosicurezza.
19. In un nuovo beuta sterile, pipetta 10 ml di SDM79. Trasferire le cellule trasformate al pallone con 10 ml di SDM79.
20. Incubare senza selezione della droga per 24 ore a 27 ° C, 5% di CO _2. Dopo 24 ore, aggiungere G418 (15 mg / ml), igromicina (50 mg / ml), e blasticidin (10 mg / ml). Passare 1 ml di cellule trasformate con la droga in 9 ml di SDM79 con la droga.
21. Analizzare le cellule quotidianamente come descritto nelle sezioni 6 e 7 Quando le cellule sono fluorescenti, e hanno raggiunto una densità cellulare di 1 x 10 ⁷ / ml, fare stabilates per la conservazione a lungo termine (3.1-3.3).

ve_title "> 3. Fare Stabilates

1. Per rendere congelamento supporti, aggiungere un volume equivalente di 100% glicerolo a cytomix e filtro sterilizzare.
2. Aggiungere 200 ml di mezzi di congelamento a 800 ml di cellule (1 x 10 ⁷⁾ in una provetta Microbank ™, mescolare delicatamente per inversione e posto tra due rack di polistirolo e congelare a -80 ° C.
3. Una volta congelato (~ 24 ore), le cellule di trasferimento per l'azoto liquido. NOTA: E 'importante spostare le celle in LN ₂ dopo 24 ore, come una conservazione più lunga a -80 ° C porta ad una diminuzione della vitalità cellulare.

4. Azioni Scongelamento congelati

1. Rimuovere flacone congelato da -80 ° C e scongelare a temperatura ambiente per circa 10 min.
2. Pipettare 9 ml di SDM79 con la droga in una nuova boccetta sterile. Aggiungi cellule scongelati a questo fiasco. Passare cellule 1:10 aggiungendo 1 ml di questa coltura a 9 ml di SDM79 in un'altra beuta (concentrazione finale di 1 x 10 ⁵ / ml).
3. Prima che le cellule raggiungono una densità di 10 ⁷ / ml, iniziare citometro sete saggi di diluizione.

5. citometro Setup

1. Accendere il citofluorimetro e aprire il programma CFLOW più. NOTA: Prima di eseguire i campioni, i fluidica dovrebbero essere backflush e risciacquati in base alle fasi 5,2-5,7.
2. Sostituire il tubo di acqua Nanopure in cui il SIP viene memorizzato con un tubo vuoto.
3. Selezionare il pulsante "controlavaggio".
4. Una volta backflush, rimuovere provetta da sorseggiare e scarto.
5. Posizionare una nuova provetta contenente 1 ml di acqua nuova Nanopure sul sorso.
6. Selezionare un nuovo pozzo in programma CFLOW. Sotto "Limiti Run" impostare il tempo per 2 min. Sotto "Fluidics" selezionare "veloce" e "Run".
7. Una volta che il limite di tempo di 2 minuti, fare clic sul pulsante "Elimina dati di esempio".

6. conteggio cellulare utilizzando il citometro di flusso

1. Sostituire l'acqua con il campione da contare. Impostare "Limiti Esegui "per 30 secondi," pneumatica "a" veloce "e quindi selezionare" Esegui ".
2. Dopo il termine di 30 sec è completa, CFLOW oltre fornirà gli eventi / ml sotto "Ultima esecuzione." Numero di ripetizioni per ogni cultura. NOTA: Prima di cellule raggiungono 1 x 10 ⁷ cellule / ml, procedere con test di diluizione. Le cellule devono essere interrotti dopo un test di diluizione viene completata. Le cellule in coltura per periodi più lunghi perdono la loro capacità di rispondere alle condizioni ambientali.

7 fluorescenza di misura utilizzando il citometro di flusso

1. Per valutare la fluorescenza, impostare "Limiti Run" a 10.000 eventi, e "pneumatica" per "rallentare". Selezionare "Imposta soglia". Sotto "Threshold Primaria", selezionare "Permanentemente eliminare eventi su", "FSC-H" (nella casella a discesa) e immettere meno di 30.000. Fare clic su "Applica", quindi su "Chiudi".
2. Selezionare il220, "pulsante in una delle nuove finestre trama e selezionare" Istogramma FSC-A "Dal menu a tendina, selezionare" FL1-A ". NOTA: misure FL1-A fluorescenza a lunghezza d'onda 530 nm.
3. Selezionare "Esegui" e ripetere per tutte le culture.
4. Eseguire pulizia soluzione attraverso la linea fluidica per 2 min e acqua per 2 min.

8. diluizione saggi

1. Passare cellule ad una densità di 1 x 10 ⁵ cellule / ml in 3 ml di SDM79 in un pallone di 25 centimetri ² cultura e misurare fioritura immediatamente dopo passaggio e poi alle 3 ore e 24 ore.

Analisi dei dati 9.

1. Selezionare "Analizza" linguetta CFLOW più.
2. Fare clic apparirà il pulsante "Istogramma" sotto "Crea una nuova trama." Select "FSC-A" e un elenco a discesa. Selezionare il canale "FL1-A."
3. Evidenziare un bene da analizzare. Selezionare il pulsante "Gate", e disegnare a mano un cancelloper la popolazione di interesse.
4. Flusso Inoltre fornirà cella "conte" all'interno di questa porta e "% di questo complotto".

Risultati

In questo sistema, è stato osservato un cambiamento glucosio-dipendente glycosome composizione. Quando le cellule sono coltivate in terreni contenenti glucosio, si osservano due popolazioni; una luminosa e una dim (Figura 2A). Cellule Dim porto glycosomes immaturi, che non hanno importato la PTS2eYFP mentre le cellule luminose ospitano un mix di maturi e immaturi glycosomes ^12. Quando il glucosio è presente nei media, mislocalization di glycosome proteine ​​è letale ^15,28 e ...

Discussione

Glycosomes sono,, organelli specifici del parassita dinamiche essenziali. I processi che regolano la biogenesi, la manutenzione, la proliferazione e rimodellamento di questi organelli probabilmente sono bersagli farmacologici che potrebbero essere sfruttati per scopi terapeutici. Nonostante l'elevato potenziale abbondanza di tali bersagli farmacologici, il campo di glycosome biogenesi è rimasta indietro lo studio dei processi simili in altri organismi, prevalentemente a causa della mancanza di un sistema high-throu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A10781	SDM79 Ingredient
L-Alanine	Avocado Research Chemicals Ltd	A15804	SDM79 Ingredient
L-Arginine	CalBiochem	1820	SDM79 Ingredient
p-Aminobenzoic acid	ICN Biomedicals	102569	SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)	Sigma	B6891	SDM79 Ingredient
Biotin	Fisher	BP232-1	SDM79 Ingredient
Calcium chloride	VWR	BDH0224	Cytomix
EDTA	Fisher	S311-100	Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit	Omega Biotek	D2500-01	DNA purifiation
Research grade Serum	Fisher	03-600-511	SDM79 Ingredient
Folic acid	ICN Biomedicals	101725	SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl	ICN Biomedicals	194671	SDM79 Ingredient
Glucose	GIBCO	15023-021	SDM79 Ingredient
L-Glutamine	CalBiochem	3520	SDM79 Ingredient
Glycerol	Acros Organics	Ac15892-0010	Freezing media
Graces insect cell media powder	GIBCO	11300-043	SDM79 Ingredient
Hemin	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Guanosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A11328	SDM79 Ingredient
HEPES	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Magnesium chloride	Fisher	BP214-500	Cytomix ingredient
L-Methionine	Fisher	BP388-100	SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50x)	Cellgro	25-030-CI	SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100x)	Lonza	13-114E	SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine	Cellgro	10-010-CM	SDM79 Ingredient
MOPS	Fisher	BP308-500	SDM79 Ingredient
Sodium biocarbonate	Fisher	S233-500	SDM79 Ingredient
Penicillin-streptomycin Solution	Cellgro	30-002-CI	SDM79 Ingredient
L-Phenylalanine	ICN Biomedicals	102623	SDM79 Ingredient
Potassium chloride	Fisher	P217-500	Cytomix ingredient
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Fisheer	P290-212	Cytomix ingredient
L-Proline	Fisher	BP392-100	SDM79 Ingredient
L-Serine	Acros Organics	56-45-1	SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt	Acros Organics	113-24-6	SDM79 Ingredient
L-Taurine	TCI America	A0295	SDM79 Ingredient
L-Threonine	Acros Organics	72-19-5	SDM79 Ingredient
L-Tyrosine	ICN Biomedicals	103183	SDM79 Ingredient
E.Z.N.A. Cycle Pure kit	Omega Biotek	D6492-02	DNA purification
Binding buffer	Omega Biotek	PDR041	DNA purification
SPW wash buffer	Omega Biotek	PDR045	DNA purification
Gene Pulser Xcell	Biorad	165-2660	Trypanosome transformation
4 mm Electroporation cuvettes	VWR		Trypanosome transformation