형광 단백질을 사용하면 아프리카 Trypanosome에서 Glycosome 역학을 모니터링하려면

요약

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

초록

Trypanosoma brucei는 가축 ^일에, 인간의 아프리카 트리파노소마 증 (HAT) 또는 수면 질병 및 소모성 질환, nagana 원인 kinetoplastid 기생충이다. 포유류의 호스트의 혈류와 체체 파리 벡터 사이의 기생충 번갈아. 많은 세포 소기관의 구성은 서로 다른 세포 외 조건 ^2-5에 대한 응답으로 변경됩니다.

Glycosomes은 작용에 관여하는 효소의 많은 실형되는 고도로 전문화 페 록시이다. 개발과 환경 규제 방식 ^4-11 Glycosome 구성이 변경됩니다. 현재 glycosome 역학을 연구하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 기술은 전자와 형광 현미경 아르; 비싸고, 시간과 노동 집약적 및 고 처리량 분석에 쉽게 적응하지 않은 방법.

이러한 제한, 형광등 glycosome 기자 시스템을 극복하기 위해¹² glycosomes하는 융합 단백질을 지시하는 퍼 옥시 대상 시퀀스 (PTS2)에 융합되는 노란색 형광 단백질 (EYFP)를 강화하는 설립되었습니다. PTS2eYFP 융합 단백질의 수입시에, glycosomes 형광된다. 소기관 저하 및 유동 세포 계측법에 의해 측정 될 수있는 형광 손실 재활용 결과. 셀은 다수의 (5000 세포 / 초)와 같은 고정 및 장착으로 광범위한 샘플 준비없이 실시간으로 분석 할 수있다. 이 방법은 환경 조건의 변동에 응답하여 소기관 조성의 변화를 검출 신속한 방법을 제공한다.

서문

Trypanosoma brucei 소 아프리카 인간 수면병 및 소모성 질환, nagana을 발생합니다. 이들 질환의 치료에 사용되는 약물은 백신을 사용할 수없는, 낡은 매우 독성이며, 약제 내성의 개발을위한 잠재적 인 신규 ^한 약물 표적에 대한 검색을 필요로한다.

수명주기, T. 중 brucei, 곤충 벡터와 포유류의 호스트 번갈아; 기생충이 생존해야하는 매우 다른 환경을 제시 두 호스트. 기생충이 상이한 환경 조건에 노출되는 형태로 대사 및 변경이 발생할 수. 가장 극적인 변화 중 일부는 단일 막 경계 기생충 특정 microbodies에서 관찰되고, glycosomes ^{13 불린다.}

포도당 수준이 상대적으로 높은 아르 (~ 5 mM)을 혈류와 혈류 기생충 (BSF)의 작용도 ë 통해 독점적으로 ATP를 생성ILE 미토콘드리아 대사는 ^14을 억압한다. 다른 진핵 달리하는 작용은 세포질에서 발생 T. brucei는 glycosomes ^{(14, 15)에서} 당분 해 효소의 대부분을 compartmentalizes. 기생충은 bloodmeal 동안 체체 파리에 의해 촬영 및 즉석 섭취되는 15 분 이내에 발견 할 수없는 수준으로 떨어지는 혈당 강하를 경험하게된다. 곤충들의 대사, procyclic 형태 (PCF)는 기생충보다 유연하고 글루코스뿐만 아니라, 프롤린 등의 아미노산, ATP ^16-18의 합성에 사용될 수있다. 비교 단백체 연구는 라이프 사이클 glycosomal에 따라 변화와 혈류 기생충 증가 당분 단백질과 미토콘드리아 단백질과 TCA 사이클과 호흡 체인 ^{13, 19에} 관여하는 미토콘드리아 단백질을 알 수있다. 많은 연구가 BSF와 PCF glycosomes의 차이점에 초점을 맞추고있는 반면, 거의 ENV에 대한 응답으로 발생하는 PCF의 glycosomes의 변화에​​ 대해 알려진ironmental 변경됩니다.

파리의 hindgut에서 포도당 수준은 수유 ^20시 일시적인 증가로 낮다. 시험 관내 (in vitro) 연구에서 대부분으로, PCF 기생충은 포도당을 포함하는 배지에서 재배되고 있습니다. 그러나, 최근의 연구는 크게 님의 PCF 대사 변경 가용성 ^{17 포도당} 것을 증명하고있다. 글루코오스, 프롤린 흡수 및 프롤린 탈수소 효소 활성의 증가 ^(18)의 부재. 미토콘드리아 대사의 변화가 예상 glycosome 조성물 및 형태의 변화를 수반하지만, 이것은 직접 평가되지 않았다.

전자 및 형광 현미경은 일반적인 기술은 T.에 glycosome 역학을 연구하는 데 사용됩니다 brucei ^2,21-24. 이러한 프로토콜은 시간 및 비용이 많이, 실시간 연구 및 높은 처리량 프로토콜에 적응하기 어려운 노동이다. , 소기관 형광 리포터 시스템을 U 이러한 한계를 극복하기 위해포유류와 효모 시스템의 세포 기관을 공부 나오지는 T.에 사용하기 위해 수정되었습니다 brucei ^12.

형광등 - 세포 소기관 기자 시스템은 광범위하게 효모, 식물 및 동물 세포 ^{25 ~ 27로} 높은 진핵 생물에서 사용되어왔다. 이러한 시스템에서, 형광 단백질은 특정 세포 내 소기관으로 단백질을 표적 아미노산 서열에 융합된다. 대상 단백질의 분해 나 합성은 형광을 통해 측정되고, 세포 기관의 구성의 변화는 세포의 형광의 변화에​​ 의해 반영됩니다.

강화 된 노란색 형광 단백질 (EYFP)의 오픈 리딩 프레임 타입 II 페 록시 타겟팅 시퀀스 (PTS2) ^12에 융합 될 때, PTS2eYFP 단백질 성숙, 수입 능력 glycosomes 형광으로 가져가 유동 세포 계측법을 통해 모니터링 할 수 있습니다. glycosome 조성의 변화는 세포의 형광의 변화에​​ 의해 반영됩니다. 이 시스템은 레졸에 도움이 될 수 있습니다glycosome 조성물 중의 환경 변화에 의한 규제 메커니즘 ving.

이 원고 생방송 기생충 실시간 glycosome 역학을 모니터링하는 유동 세포 계측법과 관련 PCF 기생충에 glycosome 리포터 시스템의 생성을 설명하고, 그것이 다른 환경에 응답 glycosome 조성의 변화를 수행하기 위해 사용 된 방법의 예를 제공한다. 신선한 미디어 glycosome 구성의 변화를 트리거로 요약하면, glycosome 조성물은 세포의 포도당 농도와 로그 상 문화의 통과에 의해 영향을 받는다. 이 시스템은 트리 파노 솜 및 기타 기생충의 다른 세포 소기관의 동적 거동을 연구하기 위해 수정 될 수 있습니다.

프로토콜

1 일반 Trypanosome 축산

1. SDM79 미디어 준비 (표 1)에 대한 고체의 무게를 측정.
2. 4 50 ML 원뿔에서 °의 C 또는 지퍼락 백에 보관하십시오. 참고 : 시약 6 개월 이상 안정적이다.
3. 해동 소 태아 37 ° C의 수조에서 혈청 (FBS), 그리고 반전에 의해 주기적으로 섞는다. 참고 : FBS는 멸균 솔루션으로 공급 업체에서 수신된다. FBS 살균 필터 기생충의 성장을 지원하는 능력을 감소시킨다.
4. 전체 병 해동되면, 열은 혈청 성분의 석출을 최소화하기 위해 주기적으로 혼합, 56 ° C의 수조에 30 분 동안 혈청을 비활성화한다.
5. 해동 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액 (펜 / 연쇄상 구균), 헤민 (50 mM의 수산화 나트륨 2 ㎎ / ㎖) 및 실온에서 기본 배지 독수리 비타민 솔루션입니다.
6. 1,000 ml의 눈금 실린더에, 액체 성분 (표 2)에 SDM79 고체 (표 1) 20.2 g을 추가하고 저어 접시에 잘 섞는다.
7. 7.35로 산도를 조정하고, 물을 850 ml의 볼륨을 가지고.
8. 필터는 필터 병의 바닥에 진공 호스를 연결하여 미디어를 소독. 솔루션이 필터링 될 때까지 진공을 적용합니다.
9. 생물 안전 캐비닛에 필터 상단을 제거하고 FBS 불 활성화 열 150 mL를 넣고. 멸균 모자 및 인감 미디어 병에서 플라스틱 덮개를 제거합니다.
10. 다음의 예외 SDM79와 동일한 방식으로 SDM80 매체를 준비; 포도당 또는 글루코사민을 추가하고 글루타민없이 MEM을 사용하지 마십시오. 열 불 활성화 FBS 150ml의 대신에, 135 불 활성화 투석 된 FBS, 열 ml의 열 불 활성화 FBS 15ml를 추가.
11. 27 ° C에서 10 ml의 적절한 매체와 25cm ² 플라스크에 5 % CO ₂ 문화 PCF 기생충. NOTE : 세포 사이토 혈구 또는 흐름을 이용하여 매일 계산한다 (섹션 6 참조), 배양 물 1 × ^105, 5 × ¹⁰⁶ 세포 / ml 사이의 밀도로 유지해야한다.

2 TR형광 리포터 구성체 PCF 기생충의 ansfection

참고 : 강화 된 노란색 형광 단백질에 융합 돌라의 퍼 옥시 타겟팅 시퀀스 (PTS2)를 포함 리포터 단백질은 기생충으로 표현된다, glycosome 역학을 따르십시오. 융합 단백질을 코딩하는 서열은 프로모터 procyclin 튜 불린 intergenic 영역 게놈에 직접 상동 재조합과 선택 블라스트 내성 유전자를 포함 pXS2bla ¹² 내로 클로닝된다. T7 중합 효소 및 테트라 사이클린 억제 (PF29-13)를 코딩하는 유전자를 품고 Procyclic 세포주 타겟팅 구조, pXS2로 형질 전환됩니다 PTS2eYFP.

1. 표 3에 나열된 구성 요소를 혼합하여 cytomix를 준비합니다. RT에서 살균 및 저장 필터링합니다.
2. DNA (1 μg / μL), 5 ㎕를 제한 효소 완충액 33 μL, 물 10 μL 피펫 팅하여 MluI로 플라스미드 DNA를 선형화하고, 2 μ; 마이크로 원심 튜브에 효소 MluI 리터. 1 시간 동안 37 ° C에서 품어.
3. 제한 제한 효소 소화에 결합 완충액 중 1 부피를 첨가하여 다이제스트 정제. 소용돌이로 교반하여 바인딩 버퍼와 소화 DNA를 섞는다. 간단히 튜브의 바닥에 시료를 수집하는 원심 분리기.
4. 2 ML 수집 튜브에 열을 바인딩 DNA를 삽입하고 전송 컬럼에 완충 용액을 바인딩 / DNA를 소화.
5. 1 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기. 원심 분리 후, 포집 관에서 여과 액을 취소하고 포집 관에 열을 반환합니다.
6. 1 분 동안 10,000 XG에서 SPW 세척 버퍼와 원심 분리기 700 μl를 추가합니다.
7. 포집 관에서 폐기 여과 액 컬렉션 튜브에 열을 반환하고 SPW에게 세척 단계와 원심 분리를 반복합니다.
8. 10,000 XG에 3 분 취소 여과, 포집 관에 반환 열, 원심 분리기 빈 열 잔류 에탄올을 제거합니다.
9. 생물 안전 캐비닛에서, COL 던져멸균 microcentrifuge 관에서 성귀 튜브와 장소 열.
10. , DNA를 용출 열 멸균의 25 μl를 추가하고 2 분 동안 실온에서 배양합니다. 1 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기.
11. 열에 바이오 안전성 후드에서 멸균의 또 다른 25 μl를 추가하고 2 분 동안 실온에서 배양.
12. 1 분 동안 10,000 XG 속도로 원심 분리기.
13. 생물 안전 캐비닛에서 새로운 멸균 microcentrifuge 관에 DNA의 전체 볼륨을 전송합니다. 참고 :이 단계는 원심 분리 동안 열린 덮개에서 오염을 방지 할 수 있습니다.
14. 필터 살균 cytomix의 400 μL에 살균, 정화, 선형화 된 DNA (10 μg)를 추가합니다.
15. 실온에서 15 분 동안 800 XG에서 원심 분리하여 5 X10 ⁷ -10 ⁸ 세포를 6 절에서 설명하고 수확으로 세포를 계산합니다.
16. 상층 액을 붓고 1 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 DNA + cytomix의 450 μL에있는 세포 펠렛을 resuspend.
17. CE를 포함하는 전송 솔루션 LLS, 일렉트로 챔버에서 멸균 4mm 갭 큐벳과 장소 큐벳에 DNA 및 cytomix.
18. "지수 붕괴"를 선택하고 수동으로 다음과 같은 설정을 입력 전압 : 1.5 kV로, 용량 : 25 수동 초점, 저항 : Ω, 및 큐벳 : 4mm입니다. 를 눌러 펄스입니다. 펄스가 완료되면, 전기 천공 큐벳을 챔버로부터 분리하고 바이오 캐비닛로 복귀.
19. 새로운 멸균 플라스크, 피펫 SDM79 10 ㎖로. SDM79 10 mL로 플라스크에 형질 전환 세포를 전송합니다.
20. 27 ° C, 5 % CO _2에서 24 시간 동안 약물의 선택없이 품어. 24 시간 후에, G418 (15 μg / ㎖), 하이 그로 마이신 (50 μg / ㎖), 및 블라스트 (/ ㎖ 10 μg)를 추가한다. 마약 SDM79의 9 ML에 약물로 형질 전환 된 세포를 1 ㎖를 전달합니다.
21. 섹션 6 및 7 세포 형광 아르에서 설명하고, ⁷ × 105 / ㎖ (1)의 셀 밀도에 도달 한 바와 같이 장기간 저장 (3.1-3.3) 용 stabilates을 매일 세포를 분석한다.

ve_title "> 3. Stabilates 만들기

1. 미디어를 동결하려면 소독 cytomix 및 필터하기 위해 100 %의 글리세롤의 동일한 볼륨을 추가합니다.
2. cryovial의 셀 800 μL (1 × 10 ^7)에 동결 매체의 200 μl를 추가,이 스티로폼 랙 사이에 반전과 장소에 의해 부드럽게 혼합하고 -80 ° C에서 동결.
3. (~ 24 시간) 냉동 일단, 액체 질소로 전송 세포. NOTE : C는 세포 생존율의 감소에 이르게 ° -80 이상에서 스토리지로, 24 시간 후에 ₂ LN 세포로 이동하는 것이 중요하다.

4 해동 냉동 주식

1. 약 10 분 동안 실온에서 C와 해동 °에서 -80 냉동 유리 병을 제거합니다.
2. 새로운 멸균 플라스크에 마약 SDM79의 피펫 9 ML. 이 플라스크에 해동 세포를 추가합니다. (1 × 10 ⁵ / ㎖의 최종 농도) 새로운 플라스크에 SDM79의 9 ml의이 문화의 한 ML을 추가하여 세포에게 1:10 전달합니다.
3. 10 ⁷ 세포 / ㎖의 밀도에 도달하기 전에, 설정 시작 사이토최대 희석 분석.

5 사이토 설치

1. 흐름 cytometer를 켜고 cflow는 Plus 프로그램을 엽니 다. 참고 : 모든 샘플을 실행하기 전에 유체가 단계 5.2-5.7에 따라 역류 세척 및 세척해야한다.
2. 모금이 빈 튜브를 저장하는 nanopure 물 튜브를 교체합니다.
3. "역류"버튼을 선택합니다.
4. 백 플러시가 완료되면, SIP 및 폐기에서 microcentrifuge 관을 제거합니다.
5. 모금에 새로운 nanopure 물 1 ㎖를 포함하는 새로운 microcentrifuge 관을 배치합니다.
6. cflow는 프로그램의 새도를 선택합니다. "실행 제한"에서 2 분 동안 시간을​​ 설정합니다. "유체"에서 "빠른"과 "실행"을 선택합니다.
7. 두 분의 제한 시간이 완료되면, "샘플 데이터 삭제"버튼을 클릭합니다.

흐름 사이토를 사용하여 6 셀 카운팅

1. 샘플 물을 교체하는 계산합니다. "설정실행 제한 "30 초는,"빨리 "를"유체 실행 "을"을 선택하고 선택 ".
2. 30 초 시간 제한은 cflow는 완료 플러스 ㎕의 "마지막 실행."각 문화에 대한 반복 횟수에 따라 이벤트를 / 제공 할 것입니다 후. NOTE : 세포를 1 × 10 ⁷ 세포 / ml에 도달하기 전에, 희석 분석을 진행. 희석 한 분석이 완료된 후 세포는 중단되어야한다. 장기간 배양 세포는 환경 조건에 반응하는 능력을 잃게된다.

흐름 사이토를 사용하여 7 측정 형광

1. 형광을 평가하기 위해, 만 이벤트에 "실행 제한"및 "천천히"를 "유체"로 설정하십시오. "설정 임계 값"을 선택합니다. "기본 임계 값"에서, (드롭 다운 상자), "영구의 이벤트를 제거" "FSC-H"를 선택 미만 30000을 입력합니다. 다음 "닫기", "적용"을 클릭합니다.
2. 선택220, 히스토그램 "새로운 플롯 창 중 하나의 버튼을 누르고"FSC-A FL1-A "를"드롭 다운 목록에서 다음을 선택 ". 참고 : 530 nm 파장에서 FL1-A 측정 형광.
3. "실행"을 선택하고 모든 문화에 대해 반복합니다.
4. 2 분 2 분, 물 유체 라인을 통해 세제 용액을 실행합니다.

8 희석 분석 실험

1. ^이 25cm 배양 플라스크 SDM79 3 ㎖의 1 × ¹⁰⁵ 세포 / ml의 밀도로 세포를 전달하고 이후 즉시 통과 한 후 3 시간 및 24 시간에서 형광을 측정한다.

제 데이터 분석

1. 선택 cflow는 플러스에 탭을 "분석".
2. 클릭 "새 플롯을 확인합니다."선택 "FSC-A"와 드롭 다운 목록에서 "히스토그램"버튼이 나타납니다. 채널을 선택합니다 "FL1-A."
3. 분석을 잘 선택합니다. "게이트"버튼을 선택하고 수동으로 문을 그립니다관심의 인구.
4. 흐름 플러스는 셀이 게이트 내에서 "횟수"와 "이 플롯의 %"를 제공 할 것입니다.

결과

이 시스템에서, glycosome 조성물 글루코스 의존적 변화가 관찰되었다. 세포가 포도당 함유 미디어에서 재배 될 때,이 인구가 관찰된다; 한 밝고 한 희미한 (그림 2A). 희미한 세포는 밝은 세포가 성숙하고 미성숙 glycosomes ^(12)의 혼합물을 항구 동안 PTS2eYFP을 가져 오지 않은 미숙 glycosomes를 항구. 포도당 미디어에 존재하는 경우, glycosome 단백질의 mislocalization는 ^15,28 치명적?...

토론

Glycosomes은 필수, 동적, 기생충 특정 세포 기관이다. 이러한 세포 소기관의 생합성, 유지 보수, 증식과 리모델링을 조절하는 과정은 가능성이 치료 목적으로 악용 될 수 약물 표적을 포함한다. 이러한 약물 표적의 가능성이 높은 풍부 불구 glycosome 생합성의 필드는 주로 급격한 동적, 소기관 반응을 모니터링하는 다루기 쉬운, 높은 스루풋 시스템의 부족으로, 다른 유기체와 유사한 프로세스를 연구 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A10781	SDM79 Ingredient
L-Alanine	Avocado Research Chemicals Ltd	A15804	SDM79 Ingredient
L-Arginine	CalBiochem	1820	SDM79 Ingredient
p-Aminobenzoic acid	ICN Biomedicals	102569	SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)	Sigma	B6891	SDM79 Ingredient
Biotin	Fisher	BP232-1	SDM79 Ingredient
Calcium chloride	VWR	BDH0224	Cytomix
EDTA	Fisher	S311-100	Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit	Omega Biotek	D2500-01	DNA purifiation
Research grade Serum	Fisher	03-600-511	SDM79 Ingredient
Folic acid	ICN Biomedicals	101725	SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl	ICN Biomedicals	194671	SDM79 Ingredient
Glucose	GIBCO	15023-021	SDM79 Ingredient
L-Glutamine	CalBiochem	3520	SDM79 Ingredient
Glycerol	Acros Organics	Ac15892-0010	Freezing media
Graces insect cell media powder	GIBCO	11300-043	SDM79 Ingredient
Hemin	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Guanosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A11328	SDM79 Ingredient
HEPES	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Magnesium chloride	Fisher	BP214-500	Cytomix ingredient
L-Methionine	Fisher	BP388-100	SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50x)	Cellgro	25-030-CI	SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100x)	Lonza	13-114E	SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine	Cellgro	10-010-CM	SDM79 Ingredient
MOPS	Fisher	BP308-500	SDM79 Ingredient
Sodium biocarbonate	Fisher	S233-500	SDM79 Ingredient
Penicillin-streptomycin Solution	Cellgro	30-002-CI	SDM79 Ingredient
L-Phenylalanine	ICN Biomedicals	102623	SDM79 Ingredient
Potassium chloride	Fisher	P217-500	Cytomix ingredient
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Fisheer	P290-212	Cytomix ingredient
L-Proline	Fisher	BP392-100	SDM79 Ingredient
L-Serine	Acros Organics	56-45-1	SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt	Acros Organics	113-24-6	SDM79 Ingredient
L-Taurine	TCI America	A0295	SDM79 Ingredient
L-Threonine	Acros Organics	72-19-5	SDM79 Ingredient
L-Tyrosine	ICN Biomedicals	103183	SDM79 Ingredient
E.Z.N.A. Cycle Pure kit	Omega Biotek	D6492-02	DNA purification
Binding buffer	Omega Biotek	PDR041	DNA purification
SPW wash buffer	Omega Biotek	PDR045	DNA purification
Gene Pulser Xcell	Biorad	165-2660	Trypanosome transformation
4 mm Electroporation cuvettes	VWR		Trypanosome transformation